生物信息学综述作业

MICRORNA在肝再生中的研究进展【摘要】肝脏是人体重要的实质器官，具有合成与储存养料、分泌胆汁、解毒和防御等维持生命活动所必需的多种生理功能。肝脏具有极强的再生能力。随着研究的推进，MICRORNA在肝病中的作用已成为最近研究热点。MICRORNA是类新近发现的内源性调节小RNA，通过与靶基因的互补结合进而调控基因转录后的表达水平，MICRORNA参与生物体的生长、发育、疾病和衰老等众多生命过程的各个环节，包括器官发育、物质代谢、细胞分化、凋亡和癌变等等，研究发现生物体内最少有30的基因受到MICRORNA的调节，MICRORNA是目前生命科学的研究热点和前沿领域。【关键词】MICRORNA；肝再生；基因表达调控；靶基因1、MICRORNAMIRNA概述MICRORNAMIRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，广泛分布在病毒、植物到高等哺乳动物中。参与转录后基因表达调控。大量的实验表明它们对多种生物过程起着重要的调控作用,包括胚胎发育、癌症发生等。11MICRORNAMIRNA与肿瘤的关系MIRNA分子于1993年首先被发现，第一个MIRNA分子LIN4与线虫LIN14基因几乎完全反向互补可调节秀丽隐杆线虫的发育周期。【1】目前，MIRNA已知的功能是在转录后水平调控基因的表达，主要作为基因表达的负调控因子。近年的研究表明，MIRNA表达失调与多种肿瘤相关，并且这些MIRNA可能起肿瘤抑制基因或癌基因的作用。过去,人们一直认为在所有的活体中基因表达的调控是调控蛋白的任务。然而,随着越来越多的通过非编码RNA实现的转录后调控的发现,转录后调控被认为在各种细胞过程中起着突出的调控作用。有计算表明人类基因组大约三分之二的基因都受到MICRORNA的调控。12MICRORNAMIRNA在肝病中的研究MURAKAMI等在2006年首次对包括慢性乙肝、丙肝、肝硬化及肝细胞癌等肝脏性疾病患者肝组织MIRNA表达谱进行了系统比较性分析。研究发现PREMICRORNA18、MICRORNA18和MICRORNA224在HCC中的表达明显上调，而MICRORNA199A、MICRORNA195、MICRORNA200A和MICRORNAMIR125AP0001在HCC中的表达明显下调；MIRNA92、MIRNA20、MIRNA18和PREMIRNA18的表达水平在分化差的HCC中最高，在分化良好的HCC中最低；而MIR199A的表达水平与分化程度呈正相关。【2】WANGY等比较了157个MIRNA在L9例肝癌患者肝癌组织与正常肝组织的表达水平，发现19个上调MIRNA与3个下调MIRNA与肝细胞癌发生相关，其中有4种MIRNAMIRNA199A、MIRNA200A、MIRNA125A和MIR224的表达水平与MURAKAMI的研究结果一致。【3】说明近年来，MIRNA在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥的作用倍受关注。MIRNA在肝病中的作用越来越重要。2、肝再生调节机制虽然不同肝病的发病机制不完全相同,但进展为肝纤维化拥有最终的共同途径,即被激活转化为肌成纤维细胞,继发纤维组织的大量增生和沉积。目前已知、人和动物肝脏都具有极强的调节自身生长发育和体积大小的能力。21肝再生过程及激活途径大鼠经历肝大部切除后,可在术后14H内启动肝细胞DNA复制及细胞增殖,最终可以在术后710D的时间内完全修复缺失肝组织,而人类在肝脏部分切除术后最初的7D,残肝也表现出迅速增殖再生反应,并能在术后36个月的期间完全恢复损伤【4】。肝组织损伤后,机体能精确地调控肝细胞增殖、生长,迅速恢复其原有体积和重量。但肝再生是一个特殊、复杂的细胞增殖过程。肝再生过程大致可以分为三个阶段早期阶段（启动期），中期阶段（增殖期）和晚期阶段（终止期）。总的来说,一般有两条平行的肝再生激活途径细胞因子和生长因子依赖的途径。细胞因子与相应受体结合产生细胞内信号从而激活转录因子。22肝再生的两个关键环节从目前的认识看肝细胞由G0期G1期的转变即感受态COMPETENCE形成和G1S期的转变即进展态PROGRESSION的调控是肝再生调控的两个关键环节,特定的生长因子参与了这两个环节的调控,任一步骤缺少一种或几种特定生长因子,肝细胞将不能进行增殖而返回G0期或进入细胞程序性死亡。【7】MIRNA则是通过靶定促进或阻滞细胞周期的关键调节因子，如细胞周期蛋白CYCLIN一周期素依赖胜蛋白激酶CDK复合体、周期素依赖性蛋白激酶抑制剂CDKI、磷脂酰肌醇3PI3KAKTMTOR信号级联或其他细胞生长调节基因，调控细胞周期的进程。如MIR195通过CYCLIND1、CDK6抑制RBE2F信号通路中RBE2F的磷酸化，使E2F等转录因子释放减少，从而阻断G1期向S期转化，抑制肿瘤形成。MIR26A通过CYCLIND2和CYELINE2阻滞细胞周期。3重要MICRORNAMIRNA在肝再生中的重要作用近几年科学家发现了许多在肝病中起重要作用的MICRORNA并阐述了其作用机制，比如MIRNA122,MIRNA376B、MIRNA494、MIRNA34A、MIRNA127等以及许多与肝再生相关MICRORNA，丰富了对肝病认识。31MIRNA122在肝病中的作用MIRNA122是最早被发现的、组织特异性表达的MIRNA之一，有发现表明它随着小鼠胚胎的发育在肝脏中逐渐被激活。MIRNA122是MIRNA家族的一员，参与肝脏的发育分化、基因表达调控和功能代谢。MIRNA122只在肝脏中特异性表达，并且其表达量占肝细胞总MIRNA量的70，是成人肝脏中表达最丰富的MIRNA。311MIRNA122的结构有研究结果表明人MIRNA122基因位于一个肝脏特异性表达的转录单元内，是由一个较长的前体非编码基因转录本通过剪切后产生的。这个前体转录本在进化上序列保守性不高，但其启动子区具有相当高的保守性。MIRNA122前体转录本包含两个外显子和一个内含子，具有一个相当长的3UTR，而MIRNA122茎环结构就位于其中。【9】MIRNA122前体基因启动子区位于MIRNA122保守茎环序列上游约5KB处，包含多个核受体因子结合序列如DR顺式元件和RNA聚合酶所识别的启动子顺式元件如TATABOX和CCAATBOX等，利用报告基因系统结合生物信息学分析以及序列删除和突变技术，鉴定这些元件对于MIRNA122基因表达具有重要的调节作用。312MIRNA122在肝病中的作用MIRNA122是肝脏特异高表达的MIRNA。在CAT1MRNA的弘端非翻译区存在多个MIRNA122的结合位点，它们之间协同调控，可强烈抑制CAT1蛋白的翻译。【10】已观察到在小鼠肝脏的发育过程中，随着MIRNA122表达量的增加，CAT1的表达被抑制，其MIRNA及蛋白质的含量减少。因此通过检测CAT1可了解MIRNA122在肝脏中特异表达的调控水平。试验表明在小鼠胚胎植入125D后的胎肝中即可被检测，出生之前达到表达平台期，在成人的肝细胞中每个细胞表达量达50000拷贝以上。近来的研究发现，MIRNA122在肝癌组织中表达下调，同时在肝癌来源的细胞株中也低表达，如HEPG2和HEP3B等在药物诱导的小鼠肝癌模型中，MIRNA122表达同样下调，在大鼠移植肝癌中的变化也一样这些研究结果提示，MIRNA122表达下调是在肝癌发生过程中伴随发生的事件，它是肝癌的一个重要的生物指标。【1011】313MIRNA122在肝再生研究中的新进展YIZHANG等从动物实验和临床试验两个水平评价了MIRNA122在肝脏损伤性疾病中的诊断意义。研究者构建DGALNLPS诱导的肝损伤模型，监测05、L、2、4、8小时血浆中MIRNA122和ALT水平，结果提示05H时MIRNA122的表达显著升高，而ALT在1H后才出现异常，提示MIRNA122是一种敏感而且特异性的优秀肝脏损伤标志物。朱华丽等旧在大鼠慢性肝损伤早期和晚期病变模型中发现，MIRNA122表达分别下降至正常组的270和56，指出MIRNA在慢性肝损伤早、晚期呈进行性下降，与肝损伤存在密切关系。【1313】。QIU等发现肝组织特异表达的MIRNA122可以直接下调HBSAG和HBEAG两种蛋白表达，同时上调MIRNA122和血红素氧合酶1有可能成为限制HBV复制的一种有效策略。另一方面，LANFORD等以黑猩猩作为研究对象，让黑猩猩感染HCV，再利用锁定核酸修饰的反义寡核苷酸SPC3649，下调体内MIRNA122，结果显示HCVRNA复制水平明显下降，这些黑猩猩未发现明显不良反应，说明下调MIRNA122可为抗HCV治疗策略开辟新领域；【14】同时，通过反义核苷酸技术沉默体内MIR一122，也可以改善体内脂肪代谢，对脂肪肝的药物研发也带来希望。所以要是较好控制MIRNA122在肝损伤中的表达，则可降低肝损伤程度并对肝细胞再生创造良好条件。32其他MICRORNA在肝再生中的作用研究除了MIR122在肝病中的研究较多，现在人们逐渐发起了对其他MICRORNA的研究，如MIR376B、MIR376A、MIR494、MIR34A、MIR127是最近肝再生MICRORNA研究热点。其功能在肝再生中的作用研究如下321MIR376A、MIR376B和MIR494的功能研究MIR376B、和MIR494都位于小鼠12号染色体的DLK1GTL2印记区域内，提示肝再生早期DLK1GTL2印记域内的MIRNA簇有共同的调控机制和变化趋势。通过体外增殖实验，证实MIR376B和MIR494均能显著抑制肝细胞增殖。通过MIRNA模拟物和QRTPCR的方法，推测MIR376B和MIR494可能分别通过相应靶基因影响肝细胞增殖或凋亡。同时有实验表明在肝癌组织中的表达及其生物学功能的研究在肝癌标本中检测了MIR376B和MIR376A的表达水平，发现MIR376A的表达变化趋势更明显，在大多数癌组织中的表达低于其癌旁组织，说明MIR376A表达水平的降低是肝癌发生发展过程中的一个高频事件。通过对MIR376A在肝癌组织及癌旁组织中的的表达变化与临床指征进行关联，卡方检验结果提示,MIR376A的表达变化与血清甲胎蛋白的水平有关，即血清中甲胎蛋白高的患者其癌组织中的MIR376A的表达水平也较高，由于甲胎蛋白是肝癌诊断的标志物，提示MIR376A可能辅助甲胎蛋白作为肝癌诊断潜在的标志物。【1517】另有实验发现MIR376AMIMICS处理HUH7细胞后P53表达升高了，并且HUH7细胞中PIK3R1被干扰后，P53表达也升高了。因此，我们推测,MIR376A可通过抑制PIK3R1的表达而激活P53的表达。322MIR34A在肝再生中的作用MIR34A抑制肝癌的侵袭转移。MIR34A功能研究通过体外实验，证实MIR34A能显著抑制肝细胞增殖，并且影响肝细胞周期。在细胞学水平通过QRTPCR，WESTERNBLOT和荧光素酶报告基因实验验证MET和INHIBINBINHBB，证实它们受MIR34A调控。【18】INHBBSIRNA干扰实验提示INHBB可能是一个细胞增殖促进因子。因此，推测在肝再生晚期，它可能受MIR34A调控而下调，从而有助于肝细胞增殖终止。同时有实验表明肝再生晚期INHBB和MET显著下调，提示它们在体内也受MIR34A调控。通过染色质免疫共沉淀（CHIP）PCR实验，我们发现肝再生晚期MIR34A的上调与P53也密切相关。323MIR127在肝再生中的作用MIR127具有抑制人肝癌细胞HUH7细胞增殖的作用；与癌旁组织相比人肝癌组织中MIR127的表达明显降低，其靶基因BCL6的表达则明显升高；在人肝癌细胞系HUH7细胞中MIR127也具有抑制其靶基因BCL6、SEPT7和SETD8的表达的作用；在裸鼠荷瘤模型中证实MIR127可以抑制人类肝癌细胞HUH7细胞形成的肿瘤的增殖。【1920】说明MIR127在肝再生早期的下调表达通过直接作用于其靶基因BCL6、SEPT7和SETD8促进了肝再生的启动，在人肝癌中MIR127可能通过BCL6促进肝癌细胞增殖。相关研究揭示了肝再生早期过程中的个由MIRNA介导的负性调控机制；提示了MIR127在肝癌的诊治中可能具有潜在的应用价值。结论和展望随着功能基因组学研究的深入，基因表达调控已经逐渐从单个基因点、线性的调控拓展到立体层面上多基因、基因簇乃至整个基因组的调控网络，其中对于MIRNA的功能机制研究发展十分迅速。近年来研究人员在MIRNA与肝癌等肿瘤发生领域的研究取得了较大进展。同时，肝癌特异性相关MIRNA的发现为肝癌基因治疗提供了新靶点，基于MIRNA的治疗会涉及到MIRNA和其类似物或者抑制剂如反义核酸MIRNA，从而调控细胞内MIRNA与其靶向之间的传递水平，MIRNA可作为多目标的治疗靶点，这远远超过只针对单个基因或者蛋白的治疗效果。然而，又将面临着另一种障碍如何准确靶向传递和维持体内MIRNA或者反义核酸MIRNA的稳定性，虽然目前正在研究应用脂质链接、化学修饰、特别是硫代磷酸酯、2O一甲基及稳固的核酸序列对核苷酸框架的修饰来克服这种障碍，但并不完全成熟。所以尽管MIRNA在肝癌等肿瘤学领域的研究取得了一些进展，但仅是冰山一角，仍需进一步的深入研究。参考文献【1】LEERC,FEINBAUMRL,AMBROSVTHECELEGANSHETEROCHRONICGENELIN4ENCODESMALLRNASWITHANTISENSECOMPLEMENTARITYTOLIN4CELL,1993,755843854【2】LEVYDE,LEECKWHATDOESSTAT3DOCLININVEST,2002,109911431148【3】HEINRICHPC,BEHRMANNI,HAANS,HERMANNSHM,MULLERNEWENG,SCHAPERFPRINCIPLESOFINTERLEUKINIL6TYPECYTOKINESIGNALLINGANDITSREGULATIONBIOCHEMJ,2003,374PT1120【4】杜斌，徐存栓，细胞表面受体介导的信号通路相关基因对大鼠再生的调控分析J解剖学杂志，200839（3）；316322【5】MARQUEZRT,WENDLANDTE,GALLECS,ETALMICRORNA21ISUPREGULATEDDURINGTHEPROLIFERATIVEPHASEOFLIVERREGENERATION,TARGETSPELLION1,ANDINHIBITSNFKAPPABSIGNNALINGJAMJPHYSIOLGASTROINTESTLIVERPHYSIOL,2010,2984535541【6】VINCIGUERRAM,SGROIA,VEYRATDUREBEXC,ETALUNSATURATEDFATTYACIDSINHIBITTHEEXPRESSIONOFTUMORSUPPRESSORPHSPPHATASWANDTENSINHOMOLOGPTENVIAMICRORNA21UPREGULATIONINHEPATOCYTESJHEPATOLOGY,2009,49411761184【7】DAVISBN,HILYARDAC,LAGNAG,ETALSMADPROTEINSCONTROLDROSHAMEDIATEMICRORNAMATURATIONJNATURE,2008,45472005661【8】WANGB,MAJUMDERS,NUOVOG,ETALROLEOFMICRORNA155ATEARLYSTAGESOFHEPATOCARCINOGENEESISINDUCEDBYCHOLINEDEFICIENTANDAMINOACIDDEFINEDDIETINC57BL/6MICEJHEPATOLOGY,2009,50411521161【9】NAKANOK,CHOJIIWAK,TANAKAMLOWERACTICITYOFCCAAT/ENHANCEBINDINGPROTEIN1ANDP21WAF1,AFTERPARTIALHEPATECTOMYINOBSTRUCTIVEJAUNDICEJBIOCHENBIOPHYSRESCOMMUNMUN2001,2803640645【10】GALLAUCCIRM,SIMEONOVAPP,TORIUMIW,ERALTNFALPHAREGULATESTRANSFORMINGGROWTHFACTORALPHAEXPRESSIONINREGENERATINGMURINELIVERANDISOLATEDHEPATOCYTESJIMMUNOL,2000,164【11】KONIARISLG,MCKILLOPIH,SCHWARTZSI,ETALLIVERREGENERATIONJJAMCOLLSURG,2003,1974634659【12】LATERZAOFLIML,GAETTENGELEP