牛奶中酪蛋白的分离与鉴定

牛奶中活性物质的分析,实验内容,1牛奶中水分含量的测定2牛奶中粗脂肪的提取与测定,3牛奶中酪蛋白的提取4蛋白质含量的测定,（1）牛奶中水分含量的测定,水分是食品分析的重要项目之一。水分测定对于计算生产中的物料平衡，和实行工艺监督等方面，有很重要的意义。各种食品水分的含量差别很大。例如，鲜果为69.7%-92.5%，鲜菜为79.7%-97.1%，鲜瘦肉52.6-77.4%，面粉12-14%。面包水分随品种不同略有差异，一般为32-42%水分测定法通常可分为直接法和间接法两类。利用水分本身的物理性质和化学性质测定水分的方法，叫做直接法，如重量法，蒸馏法和卡尔.费休法等；利用食品的比重，折射率，电导，介电常数等物理性质测定水分的方法，叫做间接法。测定水分的方法要根据食品的性质和测定目的来选定,一重量法,凡操作过程中包括有称量步骤的测定方法，统称为重量法，如烘箱干燥法，红外线干燥法，干燥剂法等。烘箱干燥法在一定温度和压力条件下，将样品加热干燥，以排除其中水分的方法，叫做烘箱干燥法。它包括常压烘箱法和真空烘箱干燥法。这种测定方法费时长，但操作简便，应用范围较广。应用本法测定水分的样品应符合下述条件：(1)水分是唯一的挥发物质；(2)水分的排除情况很完全；(3)食品中其他组分在加热过程中由于发生化学反应而引起的重量变化可以忽略。,二材料与仪器,材料全脂牛奶层析滤纸器材常压电热烘箱干燥器电子分析天平,三操作步骤,取一张12cm*12cm70过夜烘干的层析滤纸，称重，记为m1。准确称取一定量牛奶m2，滴于滤纸上，70烘干后称重，记为m3。计算水分含量。干物质质量m4=m3-m1水分含量（%）=（m2-m4）/m2100,（2）粗脂肪的定量测定索氏提取法一、目的要求学习和掌握粗脂肪的定量测定法索氏提取法,二、原理脂肪是丙三醇(甘油)和脂肪酸结合成的脂类化合物,能溶于脂溶性有机溶剂。本实验用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶剂这一特性，用脂溶性溶剂将脂肪提取出来，借蒸发除去溶剂后称量。整个提取过程均在索氏提取器中进行。通常使用的脂溶性溶剂为乙醚或沸点为30C-60C的石油醚。用此法提取的脂溶性物质除脂肪外，还含有游离脂肪酸、磷酸、固醇、芳香油及某些色素等，故称为“粗脂肪”。,三、适用范围与特点,适用于脂类含量较高，结合态脂类含量少或经水解处理过的，（结合态已转变成游离态），样品应能烘干，磨细，不易吸湿结块。此法经典，对大多数样品的测定结果比较可靠。但费时长（816h）溶剂用量大，需要专门的仪器,索氏提取器。,四材料、试剂与器材材料：全脂牛奶试剂：乙醚器材：索氏提取器、干燥箱、电子分析天平,索氏提取器构造,五、操作方法1抽提筒的准备2抽提将测定完水分带有干物质的滤纸折成小包放入抽提筒，再放入索氏抽提器内，连接已干燥至恒重（m5）的脂肪接受瓶，由冷凝管上端加入无水乙醚，加量为接受瓶的23体积，于60水浴上加热，使乙醚不断的回流提取，一般视含油量高低提取612小时，至抽提完全为止（用滤纸试）。,3称重,取下接受瓶，回收乙醚，待接受瓶内乙醚剩12ml时，在水浴上蒸干，再于100105干燥2小时，取出放干燥器内冷却30分钟，称重，并重复操作至恒重（m6）。取出滤纸包，于户外晾至无乙醚味，置入恒温箱内，烘干，然后移入干燥缸内冷却后称重，重复操作至恒重（m7）。,六结果处理,方法一脂肪()(m6-m5)/m4100m6接受瓶和脂肪的质量，g；m5接受瓶的质量，g；m4样品的质量(如为测定水分后的样品质量计)，g。,方法二脂肪()(m3-m7)/m4100m3未抽提滤纸包的质量，g；m7抽提后滤纸包的质量，g；m4样品的质量(如为测定水分后的样品质量计)，g。,七、注意事项乙醚为易燃有机溶剂，实验室应保持通风并禁止任何明火。抽提用的乙醚或石油醚要求无水、无醇、无过氧化物，挥发残渣含量低。因水和醇可导致水溶性物质溶解，如水溶性盐类、糖类等，使得测定结果偏高，被测样品也要事先烘干。过氧化物会导致脂肪氧化，在烘干时也有引起爆炸的危险。装样品的滤纸筒一定要严密，不能往外漏样品，也但不要包得太紧影响溶剂渗透。放入滤纸筒时高度不要超过回流弯管，否则超过弯管的样品中的脂肪不能提尽，造成误差。,八、思考题(1)本实验制备得到的是粗脂肪,若要制备单一组分的脂类成分,可用什么方法进一步处理？(2)本实验样品制备时烘干为什么要避免过热,（3）酪蛋白的提取一、目的要求掌握一种提取酪蛋白的方法掌握一种检测牛乳质量的方法,二实验原理,酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，占乳蛋白的80%82%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合。它还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量约为35g/L，比较稳定，利用这一性质可以检测牛乳中是否掺假。酪蛋白在其等电点时由于静电和为零，同种电荷间的排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，将牛乳调到pH4.6，酪蛋白就可从牛乳中分离出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被用来从酪蛋白粗制剂中将脂类杂志除去。,三仪器、原料和试剂,仪器：温度计、布氏漏斗、pH试纸、抽滤瓶、水浴锅、烧杯、量筒、表面皿、天平、离心机等原料：市售全脂牛奶试剂：无水乙醇、无水乙醚pH4.7乙酸钠缓冲液0.2mol/L乙醇、乙醚混合液：乙醇:乙醚=1:1（体积比）,四实验步骤,1、酪蛋白等电点沉淀将100mL牛乳放到500mL烧杯中，加热到40，加入到同样40的乙酸钠缓冲液中，调pH达4.7。此时有絮状的蛋白质沉淀析出。将悬浮液冷却至室温，室温放置分层，3000r/min离心15min，收集沉淀。2、水洗将pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲溶液用蒸馏水稀释10倍，洗涤粗制品三次，分别离心10分钟，得到沉淀蛋白。3、去脂将粗制品中加入10ml无水乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中，用乙醚-乙醇混合液洗涤沉淀两次，最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移去，在表面皿上摊开以除去乙醚，干燥后得到的是酪蛋白纯品。准确称重后，计算出每100mL牛乳所制备出的酪蛋白质量（g/100mL），并与理论产量（3.5g/100mL）相比较，求出实际获得百分率。,五思考题,用乙醇、乙醇-乙醚和乙醚洗涤蛋白质的顺序是否可以变换？为什么？试设计一个利用蛋白质其他性质提取蛋白质的实验,六离心机的使用及注意事项,离心机的工作原理：在离心力场的作用下，可加速悬浮液中固体颗粒沉降或漂浮的速度，从而将不同的物质分离。它是生化实验中提取、分离、纯化的常用设备，操作的关键环节是平衡。注意事项1.检查内、外套管应完整不漏，洗净离心管；2.待离心的物质装入离心管的量不应超过离心内套管体积的2/3；3.将一对离心管（含内、外套管）放在台秤上平衡；4.检查离心机正常后，将平衡好的离心管对称的放在离心机中；5.盖好离心机盖，打开电源开关，设置转速与时间，开始离心。注意一定不能超过离心机的最大离心速度！离心结束后，待离心机停止运转后，再打开机盖，取出离心管，不许用手强行使离心机停止转6用完后，将内外套管洗净，倒立放置，使其干燥，并在使用的登记薄签名。7.使用过程中，如出现故障，一定请本室的实验员排除，不许擅自处理,（4）蛋白质浓度的测定考马斯亮蓝染色法,一实验目的学会用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度,考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，最大吸收峰改变为595nm,考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度（比Lowry法灵敏4倍）在一定范围内，蛋白质和染料考马斯亮蓝结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。,二实验原理,CoomassieDye-Based蛋白质定量,三实验试剂与器材,试剂0.9%NaCl溶液标准蛋白液：牛血清白蛋白（0.1mg/ml）染液：考马斯亮蓝G250（0.01%）样品液：酪蛋白溶液器材漩涡混合器试管吸管容量瓶量筒电子分析天平比色皿722型分光光度计,四、操作方法1.标准曲线制作取14支试管，分两组按下表平行操作。试管编号0123456标准蛋白溶液(mL)00.10.20.30.40.50.60.9%NaCl溶液（mL）1.00.90.80.70.60.50.4考马斯亮蓝试剂(mL)4444444蛋白质浓度(g/mL)0102030405060A595nm摇匀，1h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色OD595nm以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。,2.酪蛋白浓度的测定称取一定量的酪蛋白，用0.9%NaCl溶液溶解定容至一定体积（使其测定值在标准曲线的直线范围内）。测定方法同上，根据所测定的OD595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(g/mL)。,五注意事项,（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5-20min内测定光吸收，因为再这段时间内颜色最稳定。（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。（3）一些阳离子如K+、Na+、Mg2+、乙醇等物质对测定无影响，而大量的去污剂如SDS等会严重干扰测定。,六722型分光光度计使用方法,1调整（1）将灵敏度旋钮调至“1”档（放大倍率最小）。调波长调节器至所需波长。（2）开启电源开关，指示灯亮，选择开关置于“T”，调节透光率100%T旋钮使数字显示100.0左右，预热20min.2校正（1）打开吸收池暗室盖（光门自动关闭），调节0%T旋钮，使数字显示为“00.0”，盖上吸收池盖，将参比溶液置于光路，使光电管受光，调节透光率100%T旋钮，使数学显示为“100.0”。（2）如果显示不到“100”，则可适当增加电流放大器灵敏度档数，但应尽可能使用低档数，这样仪器将有更高的稳定性。当改变灵敏度后必须重新校正“0”和“100”。（3）按（1）连续几次调整“00.0”和“100.0”后，如将选择开关置于“A”，调节吸光度调零旋钮，使数字显示为“.000”，即可进行下面吸光度A的测量；如将选择开关置于“C”，将标准溶液推入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示值为已知标准溶液浓度数值，即可进行下面浓度c的测量。,3测定（）吸光度的测量。将要测的试样溶液推入光路，显示值即为待测样品的吸光度值。（）浓度c的测量。将要测c试样溶液推入光路，即可读出待测样品的浓度值c。4结束测量完毕，关闭电源，将各调节旋钮恢复至初始位置。取出吸收池洗净，晾干，存于专用盒内。