基因工程复习资料

1基因工程的概念基因工程的概念利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程2蛋白质工程的概念蛋白质工程的概念在基因工程技术对编码蛋白质的基因的了解基础上，对蛋白质的氨基酸序列、结构和功能进行分析，进而通过对蛋白质的结构、氨基酸序列和翻译后的修饰等手段改变甚至创造出新的和更有效的蛋白质。21蛋白质工程主要内容主要目标蛋白质氨基酸序列的分析，蛋白质晶体结构分析，蛋白质功能预测和分析，蛋白质组分析3基因工程的诞生基因工程诞生于1973年，它是数十年来无数科学家辛勤劳动的成果、智慧的结晶。从40年代开始，科学家们从理论和技术两方面为基因工程的产生奠定了坚实的基础。概括起来，从40年代到70年代初的基因工程诞生，在现代分子生物学领域理论上的三大发明及技术上的三大发明对基因工程的诞生起到了决定性的作用31理论上的三大发现（1）40年代发现了生物的遗传物质是DNA2）50年代搞清楚了DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。（3）60年代确定了遗传信息的传递方式。确定遗传信息是以密码方式传递的，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸。32技术上的三大发明（1）限制性核酸内切酶的发现（2）对基因工程技术的突破的另一发现是DNA连接酶的发现（3）基因工程载体的发现33基因工程的里程碑1973年，斯坦福大学的SCOHEN等人，也成功地进行了另一个体外重组实验并实现了细菌间性状的转移。他们将大肠杆菌ECOLI的抗四环素TCR质粒PSCL01和抗新霉索NER及抗磺胺SR的质粒R6一3，在体外用限制性内切酶ECORI切割，连接成新的重组质粒，然后转化到大肠杆菌中。结果在含四环素和新霉素的平板中，选出了抗四环素和抗新霉素的重组菌落这是基因工程发展史上第一次实现重组体转化成功的例子。基因工程从此诞生，这一年被定为基因工程诞生的元年。4。限制性内切酶的分类I型识别特定序列，切割位点在距识别位点至少1000BP处随机切割II型识别特定序列并在识别位点处或附近切割III型识别特定序列，切割位点在距识别位点3端2527BP处随机切割限制性内切酶的识别特点1绝大多数酶的识别序列是特异的，仅有少数有变动2识别序列一般为46个碱基对，一般都富含GC3大多数识别序列具有180旋转对称的回文结构（PALINDROME）限制性内切酶的切割方式DNA经限制酶切后，产生2种类型的末端粘性末端STICKYEND和平整末端BLUNTEND端突起STICKY3END端突起STICKY5END平整末端BLUNTENDTHE5ENDISPHOSPHATE（5P）ANDTHE3ENDISHYDROXYL（3OH）2种末端种类）端突起，个数为或个核苷酸PSTI5CTGCAG35CTGCAG33GACGTC53GACGTC5）端突起，个数为或个核苷酸ECORI5GAATTC35GOHPAATTC33CTTAAG53CTTAAPHOG5同裂酶（ISOSCHIZOMER）来源于不同的生物，能识别相同顺序的限制酶同尾酶ISOCAUDAMER有些限制酶识别序列不同，但切割产生的末端是相同的限制酶的星反应STARACTIVITY在变化的条件下，限制酶识别序列特异性降低限制酶反应条件DNA（DNA的纯度与甲基化程度）、限制酶、反应缓冲液（TRISCL、NACL、MG2）、反应时间与温度OMEGA核酸酶（ISCEI）由酿酒酵母线粒体RRNA基因中的内含子编码，用于RRNA的剪切5TAGGGATAACAGGGTAAT3TATTIPPOI来自于多头绒胞菌PHYSARUMPOLYCEPHALUM基因内含子5CTCTCTTAAGGTAGC3AATT甲基化酶的种类与识别顺序1限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5甲基胞嘧啶和6甲基腺嘌呤在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同，可不同。DCM和DAM甲基化酶对限制酶的影响1）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序是完全重叠还是边界重叠2）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重叠DNA连接酶广泛存在于各种生物体内，其催化的基本反应是将DNA双链上的相邻碱基的5PO4和3OH共价结合形成35磷酸二酯键DNA连接酶不能够连接两条单链DNA分子或环化单链DNA。实际上，DNA连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上的切口（NICK）连接反应是一个吸能的反应，ECOLI及其它细菌以NAD为能源，动物及噬菌体以ATP为能源连接酶的最佳反应温度是37，但在这个温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此连接反应的温度一般在415基因工程中常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶核酸水解酶水解核酸链中磷酸二酯键内切酶在核酸的内部切割，生成寡核苷酸外切酶从核酸链的末端开始，逐步水解核酸链，释放单核苷酸5353核酸外切酶5335核酸外切酶DSDNA结构切口,缺口,断口BAL31核酸酶分离自ALTEROMONASESPEJIANABAL31菌株主要表现为3端的核酸外切酶活性，同时伴有5端外切及内切酶活性上述活性严格依赖于CA2的存在，可在反应的不同阶段通过加入螯合剂EGTA以终止反应主要用途是可控制性地截短DNA分子2外切核酸酶IIIEXOIII。从双链DNA的3OH端逐一去除单核苷酸。对无PY、PU位点的核酸内切酶活性。3磷酸酶活性去除3端磷酸基3P。RNASEH活性。主要用途是通过其35的外切酶活性使双链DNA分子产生出单链区，EXOIII用于DNA标记，EXOIII用于顺序缺失3外切核酸酶（EXO）从单、双链DNA的5PO4基末端逐步切下5PO4单核苷酸，不能降解5OH端主要用途是将双链DNA变为单链，供测序使用；除去5端突起，产生3端突起，便于加尾4S1核酸酶特异性降解单链DNA和RNA，在最适条件下,降解单链的速度比双链快75000倍最佳PH455核糖核酸酶RNASEA分离自牛胰脏，特异性降解RNA对热稳定（100加热15MIN仍具活性），抗去污剂用于除去DNA样品中的RNA分子6RNASEH降解DNARNA杂交分子中的RNA链用于CDNA文库建立时除去RNA链以便第二条链CDNA链的合成7脱氧核糖核酸酶IDNASEI内切核酸酶，降解SS和DSDNA当酶浓度很低时，DSDNA分子上将形成切口用途制备RNA样品时除去DNA分子切口移位，制备DNA探针1大肠杆菌DNA聚合酶IECOLIDNAPOLIECOLIDNAPOLI的3种酶活性53DNA聚合酶活性，要求3OH的引物和模板DNA53核酸外切酶活性，具有双链特异性35核酸外切酶活性，具有单链特异性，对DSDNA的降解活性很低，是SSDNA的过剩反应用途除去3端突起的单链DNA（在无DNTP时）补齐5突起端合成第二条CDNA切口移位制备探针2大肠杆菌DNA聚合酶I大片段用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解大肠杆菌DNA聚合酶I而得到的该酶的大片段，称为KLENOW片段。没有53外切酶活性，而保留了53DNA聚合酶活性和35外切酶活性用途用同位素标记具5端突起的DNA片段末端补平5粘性末端第二条CDNA链的合成DNA序列测定3T4DNA聚合酶53DNA聚合酶活性35核酸外切酶活性，可作用于DSDNA和SSDNA,其切除速度分别为40和4000NT/MIN4T7DNA聚合酶53DNA聚合酶活性和35核酸外切酶活性T7DNA聚合酶是所有已知的DNA聚合酶中最富延伸性，一般不受DNA二级结构的影响用基因工程方法去除35外切酶活性的T7DNA聚合酶，其聚合酶能力增加3倍测序酶5TAQDNA聚合酶分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度75，对95高温具良好稳定性，该酶不存在35外切酶活性主要用于PCR扩增6反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）AMV反转录酶来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒MMLV反转录酶鼠白血病毒酶活性以RNA或DNA为模板的DNA聚合酶活性RNASEH活性主要用于以MRNA为模板合成CDNA核酸末端修饰酶1碱性磷酸酶除去SSDNA，DSDNA和RNA分子两端的3和5磷酸基细菌碱性磷酸酶（BAP）牛小肠碱性磷酸酶（CIP）CIP对热敏感2T4多聚核苷酸磷酸激酶催化ATP中的位的磷酸基转移到SSDNA、DSDNA和RNA分子的5OH上转移反应（I）交换反应（II）用途5端末端标记分子克隆过程中获得5磷酸基末端，便于连接酶反应3末端脱氧核苷酸转移酶（TDT）5POH3TDTDATP5PAAAAAAAAOH3以3突起端的DSDNA作用效率为最高变性法提取质粒DNA的原理在变性条件（碱性或高温下，线状染色体DNA变性成为单链而完全分开，而CCCDNA虽然互补链之间的氢键断裂，但双螺旋主链骨架仍彼此缠绕在一起。当变性条件恢复时，质粒DNA迅速复性恢复天然构型，染色体DNA难以复性，交联形成不溶性网状结构，与变性的蛋白质和RNA缠绕在一起，通过离心沉淀下来，而质粒DNA存在于上清液中。CSCL密度梯度离心原理CSCL介质密度为17G/CM3，超速离心后形成119052G/CM3的密度梯度EB（溴化乙锭）可嵌入DNA两条链的碱基对之间，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应线性或开环DNA分子，因其具有游离的末端而易于解旋，故可结合相当大量的EB直到达到饱和具有CCC结构的质粒DNA由于负超螺旋的存在阻止DNA解链，因而只能结合很少的EBDNA分子中结合EB越多，其浮力密度越小，因而形成不同的浮力密度得以区分RNASE的特点抗酸抗碱,具很广PH作用范围抗高温严寒065均具活性，100也不能使之完全失活）抗变性剂（变性剂只能使之暂时失活，去除变性剂后又可恢复活性）酶活性不需要辅助因子存在范围广解决办法外源RNASE高温（干热180，4HRS），焦碳酸二乙酯DEPC处理所有溶液（TRISHCL除外）和器皿，操作者带手套内源RNASE高温抽提，强蛋白质变性剂，RNASE抑制剂，蛋白酶K等核酸的浓缩与贮存沉淀是核酸浓缩最常用的方法，其最大的优点是通过核酸沉淀来改变核酸的溶解缓冲液及重新调节核酸在溶液中的浓度，可去除溶液中某些可溶性的盐离子与杂质，在一定程度上纯化核酸沉淀DNA的最常用方法是在DNA溶液中加入1/10体积的3MNAAC（或KAC）和2倍体积的乙醇，放置1530MIN，离心收集DNA沉淀，倒去上清液，加入70的乙醇洗涤沉淀，去除残余的盐，再离心收集沉淀。贮存DNA溶于TE中，放置于4、20、70RNA溶于03MNAACPH52或DDH2O中，70长期保存可以沉淀形式贮存于乙醇中，20核酸的质量评估方法核酸浓度的测定DSDNA1OD26050G/MLSSDNA次克隆SUBCLONING或限制酶谱分析；外源DNA扩增。例子PBR322和PUC载体。上述两例中的非重组子来源有两个A酶切反应时仍未被作用的PBR322或PUC18分子B酶切后的载体分子经自我连接又形成载体分子2表达型载体（EXPRESSIONVECTOR）1特点A基因的启动子序列和终止子序列；B一般无检测标记基因；C克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）；D重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）。2结构A转化单元宿主细胞转化B表达单元外源基因表达3类型型转录起始区（调控序列启动子）终止子型转录起始区翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）终止子型转录起始区翻译起始区信号肽链编码区终止子（常称之为表达分泌型载体）4用途A表达外源基因以产生大量外源基因产物B用于构建CDNA文库5注意事项A启动子来源B终止子来源C启动子的启动效率D信号肽来源与结构E调控类型温控型载体PBEU1，PBEU2UHLINETAL197930受控温度中等拷贝数升温至3523小时后，细胞死亡，质粒DNA可占总DNA的75。抗生素控制型新生霉素亚致死剂量（受控条件）除去抗生素（失控条件）大量质粒DNA一、ECOLI克隆载体的种类1质粒载体复制起点来自一些天然质粒。2噬菌体载体，P1和M13、FD载体，复制起点来自噬菌体。3COS质粒载体质粒载体中插入COS片段，以利于体外包装4噬粒载体（PHAGEMID）有质粒和M13、FD的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。二、质粒与质粒载体1ECOLI的质粒种类1COLE1因子（大肠杆菌素因子）多数不能进行接合转移DNA，属高拷贝松弛型。2R因子（抗药性因子）3F因子（性因子）,可接合转移DNA，属低拷贝严紧型，质粒较大，操作不便2质粒的特点1质粒DNA复制与染色体复制无关2质粒DNA以超螺旋形式存在3质粒DNA可以接合转移4质粒的不相容性和不相容群5质粒DNA的消除化学和物理法吖啶染料，ETBR，高温等6质粒的整合F因子又可整合到ECOLI染色体中3质粒DNA的转移1）质粒DNA的转移过程2）质粒转移的必备条件转移起点ORIT,它是质粒DNA转移时的复制起点顺式作用（CISACTION）II细胞附属物性纤毛，由蛋白质构成反式作用转移过程所需的全部酶类反式作用3）质粒转移类型自我转移（SELFTRANSMISSIBLE）辅助转移（DONATION）可转