高级生化复习参考资料2013

高级生化科目复习参考资料考试说明共两类题型名词解释（12个，每个3分）；简答题（8个，每个8分）20140109晚考名词解释和简答题平均每部分各两个题目，但申业老师讲的核酸和生物膜部分可能会多出12题。注课程内容较多，整理起来比较繁琐，复习资料当中有些内容或许还不完全，作为复习参考吧第一部分核酸化学及研究方法（申业老师）橄榄枝整理名词解释基因作图GENEMAPPING在一组基因中，如果每一对基因至少与同组内的另一对基因连锁，则称这样一对基因为一个连锁群，比较一个连锁群中的不同对基因之间的重组率，可以确定基因在染色体上的排列顺序，这个过程称基因作图。组蛋白密码HISTONECODE组成核小体组蛋白的氨基末端游离于核小体之外，可以被共价修饰。该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP核糖基化等过程。尤其是组蛋白乙酰化、甲基化修饰能为相关调控蛋白提供在组蛋白上的附着位点，改变染色质结构和活性。发夹结构HAIRPINS具回文序列的单链DNA或RNA形成的结构。回文结构PALINDROMICSEQUENCE是指水平旋转180，再垂直旋转180，对称的序列结构位点特异性重组当噬菌体DNA整合到大肠杆菌染色体中时会发生位点特异性重组，重组发生在噬菌体的ATTP和大肠杆菌ATTB序列之间，重组由一种整合酶催化。问答题1述端粒延长的机制端粒是染色体末端存在特殊的序列，为简单的重复序列。端粒酶识别染色体突出的3端序列，与端粒序列互补的一段RNA序列是端粒酶复合物的一部分。前导链的悬垂部分与端粒酶RNA杂交，以RNA为模板在端粒酶作用下延长，接着端粒酶转移到前导链的末端。引发酶和DNA聚合酶最后延长端粒DNA的滞后链。2转座子类型及转座机制转座是一个DNA片段从基因组中的一个位置转移到另外一个位置的过程转座子可移动的片段称转座元件或转座子转座子两种类型转座子编码一个或两个转座必须的基因产物，同时包括10BP长的反向重复序列，位于编码序列的两端。反转录转座子RETROTRANSPOSON完成反转录需要经过RNA中间产物途径，编码反转录酶，以RNA为模板合成DNA中间产物机制基因八P5293核小体组蛋白有几种修饰以及与染色体活性之间的关系组蛋白修饰的种类乙酰化赖氨酸的乙酰化甲基化赖氨酸和精氨酸的甲基化磷酸化丝氨酸的磷酸化泛素化赖氨酸的泛素化真核生物基因组活性主要取决核小体，不仅因为核糖体定位在DNA上，还因为组蛋白精细的化学结构。组蛋白乙酰化水平增加与转录活性增强有关，而组蛋白甲基化修饰的结果则相对复杂，它可以是转录增强或转录抑制。特定组蛋白羧基端的泛素化同样影响蛋白质的降解过程，从而也可调节基因的表达。目前研究还发现组蛋白修饰与CPG岛的甲基化密切相关。4什么是转录因子，举23个例子说明常见转录因子的结构特征。转录因子结合到特异顺式作用元件上的反式作用蛋白。一般含有两个结构域一个用来识别和结合顺式作用元件，另一与其它参与转录激活蛋白的结合。碱性螺旋转角螺旋（BASICHELIXLOOPHELIX，BHLH）转录因子BHLH转录因子常形成二聚体，单体的前端有一段碱性氨基酸序列带正电荷的侧链与DNA相互作用，决定转录因子的序列特异性，两个单体的一个HELIX相互作用形成二聚体，另一个HELIX象剪刀一样插入到DNA双螺旋的大沟中。碱性亮氨酸拉链（BASICLEUCINEZIPPER,BZIP）形成一个类似剪刀的二聚体，结合在DNA分子的大沟上，每个单体包含3040个氨基酸组成的螺旋，每隔6个氨基酸含有一个LEU，LEU朝向同一方向，二聚体中LEU相互面对，结构上将螺旋向拉链一样拉到一起，形成二聚体，并插入到DNA大沟中。锌指蛋白ZINCFINGER锌指蛋白带有29个突出部分，突出部分由一个锌离子和四个氨基酸（组氨酸和半胱氨酸），插入到DNA分子的大沟中。5通过哪几种方法可以获得CDNA的全长简述其原理。1RTPCR（REVERSETRANSCRIPTIONPCR）根据基因家族各成员间保守氨基酸序列设计简并引物，并用简并引物进行RTPCR扩增，得到该基因的部分CDNA序列，再利用RACE获得CDNA全长2CDNA末端快速扩增技术（RAPIDAMPLIFICATIONOFCDNAENDS，RACE）基于PCR技术基础上由已知的一段CDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3端和5端的方法。目前己有商业化RACE技术产品推出，如CLONTECH的SMARTERTMRACE技术6简述探针标记方法和原理随机引物法利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新的DNA链。将68寡核苷酸片段与已变性的DNA单链或RNA模板退火，使该片段模板退火，使该片段随机互补结合在单链分子上，在段随机互补结合在单链分子上，在大肠杆菌DNA聚合酶IKLENOW片段作用下，以同位素标记的作用下，以同位素标记的DNTP为原料，寡核苷酸为引物的原料，寡核苷酸为引物的3OH端开始沿5至3方向，合成一条与模板互补的新DNA链。切口平移胰DNA酶I在DNA双链上随机切开若干切口，双链上随机切开若干切口，切口处形成3OH末端。大肠杆菌DNA聚合酶I以切口处开始作用，以切口处开始作用，以另一条DNA链为模板。4种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口水解5端核苷酸和3端修复加入标记核苷酸同时进行，切口平行推移。末端标记法5端标记法用碱性磷酸酶切除DNA双链分子或RNA单链5末端的磷酸基团，使其成为5OH，然后在（35S）ATP存在下，经T4噬菌体多苷酸激酶催化，将位上的35S转移到DNA或RNA分子的5OH末端，使DNA片段或RNA或寡核苷酸5端均带35S标记。3端标记法利用末端转移酶TERMINALTRANSFERASETDT在单链或双链DNA的3端催化核苷酸的合成。7哪些方法可以在转录水平上检测基因表达的差异简述其原理通过检测MRNA揭示基因转录水平的表达特征根据分析方法的原理和功能特性，可将基因表达分析分为1）封闭性系统研究方法例如DNA微阵列、NORTHERN印迹、实时RTPCR等方法，其应用范围仅限于已测序的物种，只能研究已知的基因。2）开放性系统研究方法如差异显示PCR、双向基因表达指纹图谱、分子索引法、随机引物PCR指纹分析等，可以发现和分析未知的基因。ANORTHERN印迹杂交是应用DNA探针检测特异MRNA的一种杂交技术，主要用于分析MRNA的转录或MRNA分子大小。B反转录PCR可用于MRNA的半定量分析。是一种简单、快捷地对RNA进行定性、定量分析的方法。RTPCR技术一般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测RNA样品进行半定量分析。C实时定量PCR该方法是对PCR反应进行实时监测，具有很高的灵敏度和特异性。D基因芯片又称DNA微阵列，是将大量已知序列的核酸片段（包括寡核苷酸、CDNA、基因组DNA、MICRORNA等集成在同一基片上，组成密集分子排列，通过与标记样品进行杂交，检测、获取细胞或组织的基因信息。E高通量测序技术是新一代基因表达谱分析方法，在RNA水平上可对RNA片段进行扫描、定量与鉴定，对全基因组进行广谱表达研究。哪些方法可以检测蛋白表达水平的差异简述原理。通过蛋白质检测揭示基因翻译水平的表达特征1WESTERN印迹是一种免疫印迹技术，以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质/多肽分子。2双向电泳2DE结合质谱目前采用最多的是双向聚丙烯酰胺凝胶电泳结合质谱技术，根据蛋白质分子的两个属性等电点PI和分子质量将蛋白质混合物进行分离。第一向等电聚焦电泳，依据蛋白质带净电荷数而非分子量进行分离；第二向分离SDSPAGE电泳，依据蛋白质的分子量进行分离9试述“采用功能失活策略鉴定基因功能”方法和原理功能失活策略是通过观察细胞或个体的某一基因功能被部分或全部失活后，细胞生物学行为或个体遗传性状表型的变化，来鉴定基因的功能。（1）基因突变可以使基因的功能完全缺失基因敲除GENEKNOCKOUT利用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。此法可产生精确的基因突变，从而到基因敲除的目的。随机诱变RANDOMMUTAGENESIS通过辐射、化学诱变剂或随机TDNA插入使基因组产生随机诱变，从而使基因的功完全缺失。（2）基因沉默可以使基因的功能部分缺失RNA干涉（RNAINTERFERENCE，RNAI）近年来研究发现，当一些小分子量的外源双链RNA进入寄主细胞后，便可促进与其同源的内源MRNA发生特异性的降解作用，从而高效而特异地阻断体内相应基因的活性，在细胞内发挥基因的剔除作用。分子机制异常的单链RNA分子在RDRP作用下合成双链RNADSRNA分子。MICRORNAMIRNA是内源的SIRNALIKERNA，参与了动植物发育相关基因的表达调控。MIRNA的前体PREMIRNA是颈环区域带有BULGES的小发卡RNASMALLHPRNA。所有的DSRNA，HPRNA和PREMIRNA都可以由DICER加工成21NTRNA的双螺旋，21NTRNA的双螺旋和UNWOUNDSSRNA掺入到RISC复合体中。植物中，DSRNA和PREMIRNA可由不同的DICERLIKE蛋白加工，动物中，MIRNA与MRNA部分互补，抑制翻译。植物中，MIRNA类似于SIRNA的作用，切割有可能不完全配对的MRNA。植物中有些MIRNA也抑制翻译。反义寡核苷酸（ANTISENSEOLIGONUCLEOTIDE，ASON）也可引发基因沉默反义寡核苷酸是指能与MRNA互补配对的RNA分子，长度一般为20NT左右。反义寡核苷酸引发基因沉默的机制（1）可能是通过与靶MRNA互补结合后以位阻效应抑制靶基因的翻译；（2）也可能通过与双链DNA结合形成三股螺旋而抑制转录；（3）也不能排除通过激活细胞内的DICER酶进入RNA干涉途径而降解靶MRNA。10试述酵母双杂交的原理它是利用酵母转录因子GAL4的特性建立的。许多真核生物的位点特异性转录因子是由两个相对独立的结构域组成，比如，GAL4由两个结构域组成一个是N端的DNA结合结构域BINDINGDOMAIN,BD负责识别和结合其效应基因的上游激活序列。另一个是C端的激活域ACTIVATIONDOMAIN,AD负责与DNABD结合形成完整的转录激活因子,招募RNA聚合酶并特异性激活UAS下游的效应基因表达。用目的蛋白X的核酸序列同BD的核酸序列融合，构建BDX表达载体，称为“诱饵”（BAIT）。用目的蛋白Y的核酸序列同AD的核酸序列融合构建ADY表达载体，称为“猎物”或“靶蛋白”PREYORTARGETPROTEINY可以是CDNA文库，基因片段或基因突变体。如果X和Y相互作用,则使BD和AD两结构域在空间上靠近时,激活其下游基因表达。11试述双分子荧光互补验证的原理将荧光蛋白在某些特定的位点切开，形成不发荧光的N和C端2个多肽，称为N片段NFRAGMENT和C片段CFRAGMENT。这2个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发地组装成完整的荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发时不能产生荧光。但是，当这2个荧光蛋白的片段分别连接到一组有相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这两个融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的2个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，并在该荧光蛋白的激发光激发下，发射荧光。简言之，如果目标蛋白质之间有相互作用，则在激发光的激发下，产生该荧光蛋白的荧光。反之，若蛋白质之间没有相互作用，则不能被激发产生荧光。哪几种方法可以检测蛋白质和DNA之间的相互作用，简述原理。1酵母单杂交技术（YEASTONEHYBRID）由JLI于1993年从酵母双杂交技术发展而来，是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法；通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因。2电泳迁移率变动实验ELECTROPHORETICMOBILITYSHIFTASSAY,EMSA，是研究蛋白和DNA相互作用的一种技术。用放射性同位素标记待检测的片段（即探针DNA），然后与细胞提取物共温育，形成DNA蛋白复合物，将该复合物加到非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。通常用32P标记DNA分子，而不标记蛋白质。电泳结束后，用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置。如果细胞蛋白提取物中不存在与同放射性标记的DNA探针结合的蛋白质，那么所有放射性标记都将出现在凝胶的底部；反之，将会形成DNA蛋白质复合物，由于受到凝胶阻滞的缘故，放射性标记的DNA条带就会出现在凝胶的不同部位。3染色质免疫沉淀技术（CHROMATINIMMUNOPRECIPITATION,CHIP）目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。第二部分蛋白质结构、功能及研究技术（曹勤红老师）橄榄枝整理第一章蛋白质的分子结构及研究技术1氨基酸的分类按R基团的极性分类A具有非极性或疏水R基团的氨基酸8种，丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸/蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、缬氨酸B具有极性不带电荷R基团的氨基酸7种，丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、酪氨酸CR基团带负电荷的氨基酸酸性氨基酸2种（PH高于3时带负电荷），天冬氨酸、谷氨酸DR基团带正电荷的氨基酸碱性氨基酸3种（在生理PH时带正电荷），精氨酸胍基、组氨酸咪唑基、赖氨酸氨基第21、22种氨基酸硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸2概念蛋白质的一级结构、蛋白质的二级结构、蛋白质的超二级结构、蛋白质的结构域、三级结构、蛋白质的四级结构一级结构指氨基酸在肽链中的排列顺序。注意蛋白质一级结构和共价结构的区别蛋白质的共价结构包括肽链的数目、末端氨基酸残基组成、氨基酸排列顺序及二硫键位置等内容。二级结构指多肽链主链有规律的折叠和盘绕，是多肽链主链局部的空间排列。维系二级结构的主要作用力是氢键。主要包括螺旋、折叠、转角和无规则卷曲等类型。超二级结构在各种作用力的平衡下，若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的，在空间上可辨认的二级结构组合体，充当三级结构的构件，称为超二级结构，也称模体（MOTIF）。主要包括组合、组合和组合等类型。结构域对于较大的蛋白质分子，多肽链往往形成几个紧密的球状构象，这些球状结构之间以松散的肽链相连，这些球状构象被称为结构域。三级结构多肽链借助各种次级键和二硫键，通过盘绕折叠，形成具有特定肽链走向的紧密球状构象，称为三级结构。维持三级结构的作用力氢键、盐键、疏水键、范德华力、二硫键。四级结构具有三级结构的球状蛋白质以非共价键彼此缔合，形成一个高度有序的功能型聚集体，称为蛋白质的四级结构。其是亚基的非共价缔合。3蛋白质序列测定的一般策略蛋白质序列测定的一般步骤（1）测序前的准备工作包括纯化蛋白质、测定蛋白质的分子量、末端氨基酸残基的分析、确定蛋白质的肽链数目或亚基数目、测定其氨基酸组成、配基的确定（2）序列测定包括用至少两种不同方法断裂多肽链并分离小肽段、测定每个小肽段的序列（3）多肽链的结构重建包括确定完整多肽链的序列、确定二硫键的位置、酰胺的位置蛋白质序列测定的一般策略1测定蛋白质分子中多肽链的数目2拆分蛋白质分子的多肽链（寡聚蛋白质）3断开多肽链内的二硫桥4分析每一多肽链的氨基酸组成5鉴定多肽链的N末端和C末端残基6裂解多肽链成较小的片段7测定各肽段的氨基酸序列8重建完整多肽链的一级结构9确定半胱氨酸残基间形成的SS交联桥的位置4列举出三种测定蛋白质二级结构的方法。（1）圆二色性光谱法圆二色性当振幅相等并同步的两束左、右圆偏振光通过光活性物质时，由于该物质对这两束光的吸收不同（对振幅减少不同），从而使左、右圆偏振光变成了椭圆偏振光，这种光学效应称为圆二色性。蛋白质的圆二色性光谱只与构象有关圆二色性曲线以摩尔椭圆度或吸光率之差为纵坐标，波长为横坐标作出的曲线，称为圆二色性曲线（圆二色性光谱、CD光谱）（2）紫外差光谱法生色基团分子中能够在紫外区吸收光的基团称为生色基团；差光谱发色团的微环境决定于蛋白质分子的构象，构象改变则微环境发生变化，发色团的紫外吸收光谱也将随之变化，包括吸收峰的位置、强度和谱形状等。变化前后两个光谱之差称差光谱。一般来说，环境极性增大，引起吸收峰向短波长方向移动，称为蓝移。环境极性减小，引起吸收峰向长波长方向移动，称为红移。测定双光束紫外分光光度计两个浓度相同只是条件（PH、溶剂、离子浓度或温度）不同的蛋白质样品分别装在参考杯和试验杯中。种类溶剂微扰差光谱、PH差光谱、变性差光谱（3）荧光光谱法测定测定蛋白质分子的自身荧光。向蛋白质分子的特殊部位引入荧光探测剂，然后测定荧光探测剂的荧光。蛋白质中能发射荧光的氨基酸残基TRP（色氨酸）、TYR（酪氨酸）、PHE（苯丙氨酸）（4）激光拉曼光谱法（5）氢同位素交换法5比较X衍射法和核磁共振法测定蛋白质三维结构的优缺点。X射线晶体衍射的优越性技术比较成熟能够达到非常高的分辨率,1埃占已知结构的80以上,目前所有重要的蛋白几乎都是X射线方法解出的几乎没有分子量的限制,200万以上晶体含约4060水,基本上可视为自然状态下的结构,如酶晶体有活力收集数据快,可以全自动化可以长出膜蛋白晶体核磁共振（NMR）在生物大分子上应用优越性不需要结晶；蛋白质三维结构测定,原子分辨率下的结构与功能研究；动态结构溶液中,研究分子柔性与运动性及其它分子相互作用,测出一系列比较稳定的结构；复合物结构测定,分子识别；膜蛋白结构,已成功地用于菌视紫质及有机溶剂中细菌F1F0ATP酶的F0膜功能区的C单元的结构解析。核磁共振（NMR）的缺点必须同位素标记；数据处理复杂；目前最大MW30KD,260个残基；要求蛋白没有聚合，而且折叠良好，蛋白浓度高，量大，比较稳定；没有X线衍射的分辨率高,核磁谱仪非常昂贵。第二章蛋白质制备原理和研究技术1根据分子量大小分离蛋白质的方法及原理聚丙烯酰胺凝胶电泳原理（1）不连续体系上、下两层凝胶孔径不同；缓冲液离子组成和PH值不同；PH值不连续形成不连续的电位梯度（2）三种效应电荷效应、分子筛效应、浓缩效应聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有两种化学聚合法和光聚合法。化学聚合以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇（DTT，能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。SDS强还原剂单体蛋白质或亚基的多肽链处于展开状态，SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合成复合体。一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为14GSDS/1G蛋白质，相当于每两个氨基酸残基结合一个SDS分子。2根据蛋白质电荷性质不同分离的方法及原理等电聚焦电泳基本原理利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的PH梯度中进行蛋白质的分离和分析。根据建立PH梯度原理的不同，可分为（1）载体两性电解质PH梯度等电聚焦在电泳支持介质中加入载体两性电解质，通过直流电压在正负极之间形成稳定、连续和线性的PH梯度。蛋白质在PH梯度凝胶中受电场力作用下泳动，它的分离仅仅决定于其本身的等电点，是一个“稳态”过程。蛋白质分子一旦到达它的等电点位置，分子所带净电核为零，就不能再迁移。因此蛋白质在与其本身PI相等的PH位臵被聚焦成窄而稳的区带。这种效应称之为“聚焦效应”，它保证了蛋白质分离的高分辨率。（2）固相PH梯度等电聚焦利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定时，在滴定终点附近形成PH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，从而形成固定的、不随环境电场等条件变化的PH梯度。双向电泳双向电泳大都指第一向为等电聚焦，第二向为梯度SDS电泳。样品经过电荷和质量两次分离后，可以得到分子的等电点、分子量等信息。分离的结果不是带，而是点。3亲和层析纯化带有组氨酸标签（或GST标签）重组蛋白的原理和方法金属螯合层析利用固定相偶联的配基亚胺基二乙酸（IDA与二价金属离子发生螯合作用，该金属离子又与蛋白质分子中的某些含有巯基或咪唑基的氨基酸结合。利用这种特性进行层析分离的方法，称为金属螯合层析。金属螯合层析用途很广，尤其是分离某些重组蛋白的末端带有组氨酸标签的生物大分子极为有利。利用HISTAG标签进行亲和层析A构建表达载体，使目的基因带上HISTAG标签B表达带有HISTAG标签的目的蛋白C用NISEPHAROSEHP（GEHEALTHCARE）等介质亲和纯化目标蛋白4测定蛋白质浓度的方法和原理5盐溶和盐析的概念及原因盐溶低浓度时中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶SALTINGIN。盐析当溶液的离子强度增加到足够高，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析SALTINGOUT。盐溶的原因低浓度盐存在时，蛋白质分子吸附少量相反电荷的盐离子后，双电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因此增加了蛋白质的溶解性。盐析的原因水的活度降低（1）原来溶液中大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水；（2）原来被迫与蛋白质表面的疏水基团接触的水分子被移去溶剂化盐离子，疏水基团被暴露，疏水相互作用使蛋白质聚集而沉淀。6亲和层析的概念及一般程序亲和层析概念利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子与其配体之间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。一般程序1选择被分离蛋白质的配体（关键），将配体以适当的形式连接到支持物上（如琼脂糖）。2将支持物配体络合物以适当的缓冲夜装在柱中。3蛋白质混合物上到柱顶部。大多数蛋白质径直通过柱，能与配体相互作用的蛋白质被阻留或被固定在柱上。4洗柱，除去不需要的蛋白质。5用适当的方法将吸附在柱上的蛋白质洗下来。第三章蛋白质的结构与功能1牛胰核糖核酸酶A的变性和复性过程牛胰核糖核酸酶A经尿素和巯基乙醇处理由天然、有活性的状态变为去折叠状态，二硫键被还原，失去活性；再经除去尿素和巯基乙醇，又恢复天然构象，二硫键重新形成，活性恢复。2肌红蛋白、血红蛋白在进化中形成的多肽微环境作用（1）固定血红素基；（2）保护血红素铁免遭氧化；（3）为氧气分子提供一个合适的结合部位。3分析血红蛋白与肌红蛋白的氧结合曲线对于肌红蛋白得到的是一条双曲线；而对于血红蛋白得到的是一条S型曲线。一个肌红蛋白分子只能结合一分子氧，而血红蛋白却可以结合四分子氧，所以描述氧结合血红蛋白的方程比肌红蛋白就更复杂。S型曲线表明当第一个分子氧结合血红蛋白时并不有利，可是一旦发生结合，就使得其它的氧分子更容易与余下的3个血红素结合。4别构效应的概念大多数寡聚蛋白质调节它们的生物活性都是借助于亚基相互作用。多亚基蛋白质一般具有多个结合部位，结合在蛋白质分子的特定部位上的配体对该分子的其它部位所产生的影响（如改变亲和力或催化能力）称为别构效应。5BOHR效应的概念及生理学意义BOHR效应的概念增加CO2浓度（降低PH），能降低HB对氧的亲和力，促进氧从HB的释放，这种现象称为BOHR效应。BOHR效应的生理意义当血液流经组织特别是代谢迅速的肌肉时，由于这里PH较低，CO2浓度较高，因此有利于血红蛋白释放O2，使组织比单纯的PO2降低获得更多的氧，而氧的释放又促使HB与H和CO2的结合，以补偿由于组织呼吸作用形成的CO2所引起的PH降低，起着缓冲血液PH的作用。当血液流经肺部时，由于肺PO2高，有利于HB与O2结合并因此促进H和CO2的释放，同时CO2的呼出有利于氧合血红蛋白的生成。6镰刀形细胞贫血病的分子机理正常的血红蛋白是由两条链和两条链构成的四聚体，其中每条肽链都以非共价键与一个血红素相连接。链由141个氨基酸组成，链由146个氨基酸组成。镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白的分子结构与正常人的血红蛋白的分子结构不同。其基因发生单一碱基突变，正常基因第6个密码子为GAG，编译谷氨酸突变后变为GTG编译缬氨酸，这种单个氨基酸的替代影响了血红蛋白的正常合成，使其形态和性质发生了变化，导致镰刀型贫血症。7抗原、半抗原、抗体的概念抗原能引起免疫反应的任何分子或病原体称为抗原ANTIGEN半抗原本身无抗原性，与载体蛋白结合后有了抗原性的物质称为半抗原HEPTEN抗体（免疫球蛋白）是动物为反应外来物质的出现而合成的一种球蛋白。能与外来物质专一地结合，从而消除外来物质对机体的毒害作用。8免疫荧光标记的原理（一般步骤）A用化学方法将荧光素FLUORESCEIN与抗体结合，但不影响抗原抗体结合的活性；B用荧光抗体处理固定过的标本，在荧光显微镜下观察荧光的出现，可用以鉴定标本中的抗原，并进行抗原的定位。C用高密度颗粒，如铁蛋白，胶体金与抗体偶联，然后利用电镜观察对结合部位进行高分辨率观测。9酶联免疫的应用酶联免疫操作步骤（抗抗型）A待测样品中的蛋白质吸附到惰性表面，通常使用96的聚苯乙烯塑料板。B表面加非特异性蛋白质温育，封闭未被蛋白质覆盖的部位。C用含抗待测蛋白质的抗体（一抗）溶液处理。D洗去未结合的抗体并与二抗温育。与二抗共价连接的酶可催化无色或无荧光底物变成有色或荧光产物。E通过测量颜色和荧光的密度来确定样品中抗原的含量。酶联免疫的应用A定量生物样品中相应抗原的数量；B易于检测，可以定量少于109G的专一抗原蛋白。10免疫印迹WESTERNBLOTTING的原理及一般步骤原理将混合抗原样品在凝胶板上进行单向或双向电泳分离,然后取固定化基质膜与凝胶相贴。在印迹纸的自然吸附力、电场力或其它外力作用下,使凝胶中的单一抗原组份转移到印迹纸上,并且固相化。最后应用免疫覆盖液技术如免疫同位素探针或免疫酶探针等,对抗原固定化基质膜进行检测和分析。基本步骤免疫印迹法基本上可分为凝胶电泳、转移、封闭、一抗、酶标二抗、底物显色等步骤。第四章蛋白质相互作用的研究方法免疫共沉淀（COIMMUNOPRECIPITATION）以抗体和抗原之间的特异结合为基础，研究蛋白质相互作用；当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体来免疫沉淀X，那么与X在细胞内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。酵母双杂交（YEASTTWOHYBRIDSYSTEM）原理酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域DNABINDINGDOMAIN，BD，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域TRANSCRIPTIONACTIVATIONDOMAIN，AD。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列UPSTREAMACTIVATINGSEQUENCE，UAS结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域和单独的转录激活域都不能起作用，两者只有当结合在一起或者空间上比较接近时，才能具有完整的转录激活因子的功能。双分子荧光互补BIMOLECULARFLUORESCENCECOMPLEMENTATION，BIFC原理利用黄色荧光蛋白YFP作为报告基因，将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段，再分别与目标蛋白连接。如果两个目标蛋白因为相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光。在荧光显微镜下，通过直接观察荧光变化就能确定两个目标蛋白质是否具有相互作用，并且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等。噬菌体展示技术原理噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。PULLDOWN技术原理PULLDOWN技术是将已带有标记的饵蛋白（如生物素标记、HISTAG或GSTTAG）固相化，通常是将饵蛋白通过其上融合的标签特异地结合到相应填料上，再与待检验互作的目标蛋白在填料上结合（目标蛋白不带标签或者与饵蛋白带不同标签），然后用洗脱缓冲液将填料上的饵蛋白洗脱下来，最后应用聚丙烯酰胺凝胶电泳或者免疫印记分析洗脱出的蛋白溶液成分，从而确定饵蛋白与目标蛋白是否在体外形成了复合物。FARWESTERN技术原理FARWESTERN技术是在WESTERNBLOT的基础上建立的。将饵蛋白经SDSPAGE电泳分离，并且转膜后，与待检验的目标蛋白溶液孵育，通过一抗、二抗对待检验目标蛋白的杂交，最后若能能在膜上显示阳性条带，则证明膜上的饵蛋白与待检验蛋白可能存在相互作用。染色体免疫共沉淀（CHROMATINIMMUNOPRECIPITATION，CHIP）原理在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“PROTEINA”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的PROTEINA预先结合固化在ARGAROSE的BEADS上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，BEADS上的PROREINA就能吸附抗原达到精制的目的。荧光共振能量转移FLUORESCENCERESONANCEENERGYTRANSFER,FRET原理荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时,当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态,在该电子回到基态前,通过偶极子相互作用,实现了能量向邻近的受体分子转移即发生能量共振转移。第三部分物质代谢的联系与调控（王吉贵老师）橄榄枝整理一、名词解释1新陈代谢生物体从环境摄取营养物转变为自身物质，同时将自身原有组成转变为废物排出到环境中的不断更新的过程。（或生物体与外界环境之间的物质和能量交换以及生物体内物质和能量的转变过程）2同化作用又叫做合成代谢，是指生物体把从外界环境中获取的营养物质转变成自身的组成物质，并且储存能量的变化过程。3异化作用又叫做分解代谢，是指生物体能够把自身的一部分组成物质加以分解，释放出其中的能量，并且把分解的终产物排出体外的变化过程。4恒态生物体内各种代谢中产物的含量基本保持不变。5稳态生理学家把正常机体在神经系统和体液以及免疫系统的调控下，使得各个器官和系统协调活动，共同维持内环境的相对稳定状态，叫做稳态。6反馈抑制由代谢终产物作为变构剂来抑制在此产物合成过程中某一酶（通常为限速酶）活性的作用，称为反馈抑制。7级联放大系统在连锁代谢反应中一个酶被激活后，连续地发生其它酶被激活，导致原始调节信号的逐级放大，这样的连锁代谢反应系统称为级联系统。8限速酶限速酶是指整条代谢通路中催化反应速度最慢的酶，它不但可以影响整条代谢途径的总速度，还可以改变代谢方向。9共价修饰调节在其他酶的催化作用下，酶蛋白肽链上的一些基团可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而基团可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而改变酶的活性。10代谢组学METABOLOMICS/METABONOMICS在新陈代谢的动态过程中，系统研究代谢产物的变化规律，揭示机体生命活动代谢本质的科学。其它同工酶ISOENZYME指催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。变构调节一些调节分子可与酶分子活性中心外的某部分可逆地结合，使酶构象改变，从而改变酶的催化活性。二、问答题1动物组织中物质代谢的特点（1）整体性（2）代谢途径的多样性（3）物质代谢的组织特异性（4）代谢的可调节性（5）ATP是机体能量储存和利用的共同形式（6）NADPH是合成代谢所需的还原力（7）合成和分解途径几乎总是不同的2动物组织中代谢调节的方式有哪些答细胞水平的代谢调节通过其细胞内代谢物浓度的变化来影响酶活性和酶含量的调节；激素水平的代谢调节通过各种内分泌腺分泌的激素，间接调节动物机体的活动的调解方式；整体水平的代谢调节通过神经系统或其分泌的神经递质，或通过影响激素分泌及影响各种激素的协调作用而对代谢进行的调节。如饱食、饥饿、运动、应激状态等。3动物组织细胞水平代谢的调节方式有哪些答细胞水平的代谢调节主要是酶水平的调节，其主要表现为（1）细胞内酶的隔离分布，避免了各种代谢途径互相干扰；（2）酶活性的调节，代谢途径的方向由关键酶的活性决定，代谢调节主要是通过对关键酶活性的调节而实现的，酶活性的调节包括变构调节和共价修饰调节；（3）酶量的调节，包括酶的合成和酶的降解。酶的降解主要有溶酶体和蛋白酶体，其主要是通过改变酶蛋白分子的降解速度，也能调节酶的含量。4糖代谢与脂代谢的联系答（1）当摄入的糖量超过能量消耗时，葡萄糖既可合成糖原储存在肝脏和肌肉中，也可转变为乙酰COA合成脂肪储存在脂肪组织当中；（2）脂肪分解成为脂肪酸和甘油，脂肪酸可转变为乙酰COA，甘油在甘油激酶的作用下转变成为磷酸甘油，进而转化为葡萄糖；（3）脂肪的分解代谢受糖代谢的影响当饥饿、糖供应不足或糖代谢障碍时，脂肪大量动员致使酮体生成增加；糖不足时，草酰乙酸进入糖异生途径，致使代谢产生的乙酰COA不能进入三羧酸途径，进而导致酮体生成增加，最终产生高酮血症。5糖代谢与氨基酸代谢的联系答（1）当生糖氨基酸（能通过代谢转变成葡萄糖的氨基酸，如丙氨酸）经脱氨基作用后，可生成相应的酮酸，进而通过糖异生作用转变为葡萄糖；（2）糖代谢的中间产物可氨基化生成某些非必需氨基酸，如糖代谢产生的丙酮酸可转化为丙氨酸，草酰乙酸可转化为天冬氨酸，酮戊二酸可转化为谷氨酸。6脂代谢与氨基酸代谢的联系答（1）蛋白质可转变为脂肪，生酮氨基酸乙酰COA脂肪；（2）氨基酸可作为合成磷脂的原料，丝氨酸磷脂酰丝氨酸，丝氨酸乙醇胺脑磷脂，丝氨酸乙醇胺胆碱卵磷脂；（3）脂肪的甘油部分可转变为非必需的氨基酸，甘油磷酸甘油醛丙酮酸（酮酸）氨基酸7饥饿状态下，动物体内的物质代谢状况如何（试从短期饥饿和长期饥饿两种情况来说）答（1）短期饥饿（13天），糖原消耗血糖趋于降低胰岛素分泌减少2活性中心具有三维结构3活性中心由疏水氨基酸形成口袋，极性氨基酸参与反应4底物靠弱键与酶结合。6酶的命名与分类国际分类编号系统（六大类，顺序不可颠倒）1氧化还原酶类2转移酶类3水解酶类4裂合酶类5异构酶类6连接酶类国际分类编号方案第一个数字酶的类别；第二个数字酶的亚类；第三个数字酶的亚亚类第四个数字酶在亚亚类中的排序；编号前冠以EC，是国际酶学会缩写，如EC41117合酶与合成酶合酶是催化加成反应的裂合酶；合成酶是反应需要ATP的参与，属于连接酶类。8酶作用的专一性结构专一性键专一性、基团专一性、绝对专一性；立体异构专一性旋光异构专一性、几何异构专一性。9酶作用专一性的假说诱导契合学说酶与底物在相互作用过程中，底物诱导酶活性中心发生构象变化，底物分子中的敏感键产生张力并“变形”。10酶活力是酶催化一定化学反应的能力。表示方法酶促反应速度、酶的活力单位酶促反应速度单位时间内，底物的消耗量或是产物的生成量。通常是测定反应的初速度。1个酶活力单位，是指在特定条件下，在1MIN内转化1MOL底物的酶量，或是转化1MOL底物的有关基团的酶量。1IU1MOLMIN11个KAT是指在特定条件下每秒钟催化1MOL底物所需的酶量。1KAT1MOLS1酶的比活力SPECIFICACTIVITY反映了酶的纯度。单位U/MGU酶的活力单位，MG蛋白质含量酶的分离纯化方法与蛋白质的分离纯化方法相似，在分离纯化过程中，要注意必须保持酶的活力，必须随时跟踪酶的活力。第二章酶促反应动力学1米氏方程KM米氏常数，即酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。V1/2VMAX时，KMS2KCAT表示当酶被底物饱和时，每秒每摩尔酶分子将底物转换成产物的摩尔数。KCATVMAX/ET3米氏方程应用1要求反应速度V达到VMAX的99，其底物浓度应为VVMAXS/（KMS）99VMAXVMAXS/（KMS）99（KMS）SS99KM2已知某个酶的S3KM，求反应速度V相当于VMAX的百分率。VVMAXS/KMSVVMAX3KM/KM3KMVVMAXV75VMAX3双倒数作图法例一个酶促反应中，反应速度与底物浓度的值如下SMMOLL1203350100VMMOLL1MIN125313642（1）请用双倒数作图法计算KM和VMAX并画图。（2）如果酶的浓度为4105MMOLL1，请计算KCAT（提示KCAT是每秒每个活性中心的反应速度，单位是S1）。3三种可逆的抑制作用比较竞争性抑制作用、非竞争性抑制作用、反竞争性抑制作用不可逆抑制作用有机磷化合物、有机汞、有机砷化合物、氰化物、烷化剂4温度对反应速度的影响最适温度；温度升高使酶促反应速度加快，但温度升高也可使酶变性PH影响酶活性的原因PH影响酶蛋白氨基酸侧链的解离；过酸、过碱影响酶蛋白的构象；PH影响底物的解离（这种情况比较少见）第三章酶的催化机制1过渡态学说反应中，酶E与底物S形成不稳定的过渡态ES复合物，ES再分解成产物P和酶E。2过渡态反应物的化学键处于即将生成或断裂的过程中；活化能反应物从基态达到过渡态所需的能量。酶能短暂地与反应物结合形成过渡态，从而降低了活化能，活化能（G）与反应的速度有关。但没有改变G。反应体系的自由能变化（G）与反应的平衡有关。3酶降低反应活化能的原因（1）关键原因是过渡态稳定作用一个酶的活性中心应在形状和化学性质上与底物的过渡态互补。（2）酶与底物的结合临近效应与定向效应；酶与底物地结合是弱键；底物敏感键变形；酶的活性中心是疏水的口袋。（3）酶对底物的催化酸碱催化，共价催化，金属离子催化（4）综合作用4酶原激活从酶无活性的前体转变为有活性的酶的过程。这个过程是不可逆的。5核酶是具有催化活性的RNA；抗体酶是具有催化活性的特殊抗体。第四章调节酶1别构酶以构象变化影响催化活性的酶。别构酶都是寡聚酶2别构效应调节物与酶的别构中心结合后，引起酶蛋白构象的变化，影响酶的活性中心与底物结合，从而调节酶促反应的速度及代谢过程。3别构酶的特点（1）别构酶都是寡聚酶，分子中包括活性中心和别构中心；（2）别构酶的亚基具有R、T两种构象，R型对底物亲和力高；T型对底物亲和力低。（3）别构酶具有别构效应，通过酶分子本身的构象变化来改变酶的活性；正、负别构调节剂ATP是酶的激活剂，CTP是酶的抑制剂（4）别构酶动力学曲线不符合典型的米氏方程，不呈双曲线而呈“S”形；（5）别构酶大多处于代谢的关键位置。作用机理齐变模型、序变模型4同工酶催化的化学反应相同，而酶蛋白本身的结构和化学组成亚基组成、氨基酸组成、理化性质和免疫性能）不同的酶；酶分子的共价修饰在特殊酶的作用下，将一化学基团可逆地结合于酶的表面，使酶在有活性和无活性或高活性与低活性形式间转换，借以控制代谢的方向和速度。诱导酶在细胞中加入特定的诱导物后，诱导产生的酶。其合成受到诱导物和遗传基因的双重调控。第五章维生素与辅酶维生素是一类小分子有机化合物，是生物生长发育和代谢所必需的。酶的分类单成分酶；双成分酶酶蛋白和辅因子（辅酶和辅基）。大多数水溶性维生素及其衍生物是辅酶或辅基的组成成分，如NADH、FADH2、COA第五部分糖生物学与糖组学（金诚老师）橄榄枝整理一、基本概念糖基磷酸化肌醇修饰蛋白（GPI蛋白）一种蛋白质、糖链、脂质共价结合而成的复杂的糖复合物。寡糖素植物或微生物细胞壁结构多糖水解产生的有生理活性的寡聚糖或其混合物。凝集素一种从各种植物，无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红血球（含血型物质），故名凝集素。其主要是促进细胞间的粘着。糖组一个生物体或细胞中全部糖类的总和，包括简单的糖类和缀合的糖类。在糖缀合物糖蛋白和糖脂等中的糖链部分有庞大的信息量。蛋白聚糖由蛋白质与糖氨聚糖通过共价或非共价键结合而成的一类大分子。纤维素多个葡萄糖分子组成的大分子多糖，不溶于水及一般有机溶剂。是植物细胞壁的主要成分。二、问答题1自然界中分子量最大的分子是什么它结构上有什么特点答自然界中分子量最大的分子是支链淀粉。其结构特点带1,6分支的1,4葡聚糖（平均每2430残基有一个分支），由106个GLC（葡萄糖）组成。2什么是糖缀合物它主要包括哪些化合物答糖缀合物是指糖与蛋白质或脂类形成的共价结合物。其主要包括糖蛋白、蛋白聚糖、糖脂和GPI锚定蛋白等化合物。3分析糖链结构主要有哪些方法答（1）化学法高碘酸氧化、甲基化分析、寡糖顺序降解；（2）酶学法糖苷酶通过顺序降解阐明一级结构。（3）寡糖谱分析色谱图谱可用于比较、获得糖结构的数、量、类型的信息。大样品量分析50GHPAECPAD或其他HPLC,可分析出2050不同的糖；放射或荧光标记可用于增强检测灵敏度。（4）核磁共振是糖链立体结构分析的重要方法。确定糖链的构型、连接位置、分支和微观多样性。（5）芯片技术凝集素亲和微流体芯片和芯片电喷雾质谱已应用于糖组学糖蛋白的糖型分离分析。（6）生物信息学法糖蛋白糖链研究的信息处理、归纳分析以及糖链结构检索都要借助生物信息学进行。目前借助于生物信息学构建的标准糖谱已成为样品糖链结构鉴定的主要工具。4请简述蛋白质糖基化修饰对蛋白质的影响有哪些答蛋白质上的糖基化修饰主要有两类，即N连接的糖基化修饰和O连接的糖基化修饰。其对蛋白质的影响主要有影响蛋白质的折叠、溶解度、半衰期、抗原免疫性和生物活性等。以烟曲霉为例，糖基化是烟曲霉细胞壁合成所必需的蛋白质修饰，蛋白质糖基化修饰是维持烟曲霉正常的细胞周期、极性生长、形态发生、热耐受性及毒力的重要因素。烟曲霉N糖基化修饰途径与功能小结A蛋白质N糖链加工或降解均影响细胞壁的合成，N糖链加工或降解均与细胞极性生长相关。B加工起始阶段的缺陷会引起错误折叠蛋白在ER内的积累，并导致ER胁迫和细胞骨架重排异常。C与酵母不同，烟曲霉已进化出N糖链依赖的蛋白质折叠质量控制体系；虽然烟曲霉对错误折叠蛋白有一定耐受性，但推测一些细胞壁合成相关的重要糖蛋白的折叠更依赖于N糖链加工，N糖基化修饰是这些蛋白转运和发挥功能所必需的。O糖基化修饰是另一类在从酵母到人均保守的蛋白质糖基化修饰5糖蛋白折叠的质量控制体系由哪几种分子组成它们是如何发挥作用的答在哺乳动物细胞中，ER中进行的N糖链剪切是保证糖蛋白质折叠控制的重要机制，该质量控制体系由钙连接蛋白、钙网蛋白、UDP葡萄糖、糖蛋白糖基转移酶GT和葡萄糖苷酶II组成，是哺乳动物细胞存活所必须的。作用钙连接蛋白和钙网蛋白具有分子伴侣的作用，可识别糖蛋白折叠的正确性。其他作用不知6蛋白质N糖链与O糖链生物合成的主要差异有哪些答N糖链有一致序列NXS/T，有相同的5糖核心结构，此核心结构是在进