基因工程笔记

基因工程课程笔记创建于20141031第1页共35页绪论第一节基因工程的诞生第二节基因工程的安全性第三节基因工程的应用第四节基因工程技术的商业化发展一、定义GENETICENGINEERING在体外将核酸分子插入病毒,质粒或其它载体系统中,构成遗传物质的新组合再整合到那些本来不含该类物质的宿主中从而形成一种新的可连续繁殖的有机体就是有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。CLONE从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。二、特征1跨物种性外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。2无性扩增外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达。三、基因工程的主要操作内容（供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件）1目的基因的获取从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。2重组体的制备将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。3重组体的转化将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。4克隆鉴定挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）5目的基因表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。安全性一、基因工程的安全措施（1）实验室的物理安全P1级实验室一般装备良好的普通微生物实验室。P2级实验室在P1级实验室的基础上还装备有负压的安全操作柜。基因工程课程笔记创建于20141031第2页共35页P3级实验室全负压的实验室，同时装备安全操作柜P4级实验室专用的实验大楼，周围与其它建筑物应有隔离带。具有最高安全防护措施（2）实验室的生物安全（分3级（大肠杆菌）EK1EK3级。）EK1在自然环境中一般都要死亡。EK2在自然环境中无法存活。EK3；应该是失去了自我迁移的能力。（3）载体的安全应该是失去了自我迁移的能力。不会自动从“安全”的菌株转移到“不安全”的菌株中。（容易构建）。如PMB9，PBR322等基因工程的应用PPT20页左右第一章基因操作的主要技术原理第一节DNA的提取与纯化第二节DNA的凝胶电泳第三节核酸的分子杂交第四节基因扩增技术PCR第五节DNA序列分析第六节酵母双杂交系统DNA的提取与纯化DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。原理闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；强碱中性复性基因工程课程笔记创建于20141031第3页共35页染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。所用的试剂作用溶菌酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的1，4糖苷键。在碱性条件（PH8）下有活性葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解EDTAMG2、CA2的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。NAOHSDSNAOH强碱，提供PH12的碱性条件，使DNA双链变性。SDS溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。NAACHAC缓冲液冰醋酸把醋酸钠溶液的PH调到48。用来中和NAOH变性液，使DNA复性，高浓度的NAAC有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀乙醇用于沉淀DNA，DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。RNASEA降解RNA渣滓。以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。TE缓冲液DNA保存液。由TRISHCL和EDTA配制TRISHCL不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲液），有利于以后操作；EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解酚氯仿（选用）蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在DNA溶液中。提取质粒DNA的步骤溶菌破膜蛋白质和DNA变性中和离心除去沉淀纯化DNA沉淀DNA溶菌使用“溶液”溶解细菌细胞壁。溶液50MM葡萄糖，25MMTRISHCLPH80，10MMEDTA，45MG/ML溶菌酶，RNASEA溶液II02NNAOH，10SDS溶液III3M醋酸钠（用冰醋酸调PH至48）影响质粒DNA产量的因素菌株的遗传背景，质粒自身的拷贝数DNA的定量和纯度测定1紫外光谱法（DNA（或RNA）在260NM波长处有特异的紫外吸收峰。蛋白质280）2琼脂糖凝胶电泳估计（溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能发红色荧光与已知浓度的DNA电泳带荧基因工程课程笔记创建于20141031第4页共35页电压的大小胶的浓度外因构象、极性分子大小、带电量、内因光强度对比，就可以估计出DNA含量。）DNA分子量的估计一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。MARKERDNA的凝胶电泳原理1带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为移率。2电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。3电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。电场条件相同分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开环状最慢。琼脂糖凝胶电泳（空隙大小决定其分辨分子大小的能力。）聚丙烯酰胺凝胶电泳优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。辨别一个碱基差迁移速率影响因素核酸的分子杂交DNADNA或DNARNA链杂交。用放射性同位素（32P或125I）标记的DNA或RNA探针。探针的标记原理基因工程课程笔记创建于20141031第5页共35页SOUTHERN杂交NORTHERNBLOT用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。WESTERNBLOTWESTERN杂交的总体过程也与SOUTHERN杂交相似，只不过在BLOTTING过程中转移的是蛋白质而不是DNA，这种将蛋白质样品从SDSPAGE凝胶通过电转移方式转移到滤膜的方法，称为WESTERNBLOTTING。几种核酸分子杂交比较作用材料目的SOUTHERN杂交DNA判断某生物样品中是否含有某一基因。NORTHERNBLOTRNA检测细胞或组织样品中是否存在与探针同源的MRNA分子，从而判断在转录水平上某基因是否表达。WESTERNBLOT蛋白WESTERN杂交主要用来检测细胞或组织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质，从而判断在翻译水平上某基因是否表达。原位杂交对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落（原位杂交就是将细菌菌落影印到滤膜上，或将菌种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落，对滤膜上的菌体进行原位裂解使DNA释放出来，并使之固定在滤膜上。然后通过分子杂交，判断哪个或哪些菌落含有与探针同源的DNA。菌落杂交主要用来从用质粒或COSMID构建的基因文库中寻找阳性克隆子，当得到阳性克隆子后，再通过SOUTHERN杂交进一步验证。通过这种方法在一张直径为9CM的滤膜上，可检测成几百到一千甚至上万个菌落，达到高通量筛选的目的。）基因工程课程笔记创建于20141031第6页共35页复性50OC1MIN变性94OC1MIN延伸72OC2MIN斑点杂交斑点杂交是分子杂交中最简单的一种，直接将DNA或RNA分子以斑点的形式固定在滤膜上，然后进行分子杂交。第四节基因扩增技术PCR基因扩增指生物体内或体外人工方式使基因拷贝数大规模增加。有下列五种方式扩增基因工程扩增基因组进化扩增基因的程序性扩增环境诱发扩增PCRPCR体系模板TAQ酶PRIMEDNTPS氯化镁溶液10BUFFERDD水物质体系进行前先95OC5MIN2PCR技术的原理PCR的过程（1）第一步变性（DENATURE）9495OC下5分钟模板DNA双链完全变性成单链。（2）第二步复性（ANNEAL）5060OC下1分钟，引物优先与模板复性。优先的原因是因为引物的浓度高，链短基因工程课程笔记创建于20141031第7页共35页（3）第三步延伸（EXTEND）72OC下12分钟，TAQDNA聚合酶在引物的3端上加上核苷酸。（4）第四步变性（DENATURE）94OC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。（5）第五步重复（REPEAT）反应体系（注意添加顺序，考虑经济原则）DD水10BUFFER氯化镁DNTPSPRIMETAQ酶模板影响PCR的因素（1）TAQDNA聚合酶热稳定性最适温度高TAQ酶的功能缺点具53聚合酶活性和53外切酶活性，但没有35外切酶活性。因此不能修复错误的碱基配对（合成超过600BP长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序）TAQDNA聚合酶的激活剂当DNTP（能结合MG2）的浓度为0708MMOL/L时，MGCL2的最佳浓度应是20MMOL/L。需做正交试验得到结果。（2）引物（PRIMER位置与待扩增的模板DNA区段的两3端序列互补（5端相同）的短DNA。引物的长度一般引物设计为长1530BP（按概率与特异性计算得到）引物的碱基序列3端必须与模板正确配对，5端可以不配对。5端另有很多作用引物的碱基组成尽可能提高GC含量，以提高引物与模板的结合力避免连续相同碱基排列或内部回文序列（形成发夹结构）；引物的TM值原始按照计算公式计算，现程序设计。套嵌引物（NESTEDPRIMERS设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。（3）DNTPS一般反应体系中DNTP混合液终浓度用02MMOL/L。浓度过高会抑制TAQDNA聚合酶的活性并增加错配率。（4）模板（TEMPLATE）纯度但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、MG2的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。模板的量不能太多，100L反应体系中100NG足够。PCR技术的扩展PCR技术荧光实时定量PCR借助于荧光信号来检测PCR产物。可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。反向PCR扩增两个引物外侧的未知序列把线性DNA模板转变成环形分子。不对称PCR用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。反转录PCR（RTPCR把RNA反转录成CDNA，再以CDNA为模板进行PCR扩增。NA病毒。PCR技术的应用（1）扩增某一段DNA（2）基因的体外诱变基因工程课程笔记创建于20141031第8页共35页基因工程工具酶核酸酶聚合酶连接酶修饰酶拓扑异构酶（3）基因组的比较研究DNA序列分析一、双脱氧链终止法双脱氧核苷酸分子的脱氧核糖的3位置的OH缺失。当它与其他正常核苷酸混合在同一个扩增反应体系中时，在DNA多聚酶的作用下，虽然它也能够象正常核苷酸一样参与DNA合成，以其5位置的磷酸基，与上位脱氧核苷酸的3位置的OH结合，但是，由于它自身3位置OH的缺失，至使下位核苷酸的5磷酸基无法与之结合。1原理（1）DNA复制是以一条链为模板，按碱基配对的原则进行的。（2）脱氧核糖的连接是以35磷酸二脂键。（3）复制反应可以在体外进行。（4）2和3双脱氧的DDNTP会使复制反应终止。技术要点（1）制备单链DNA模板（2）特殊的DNA多聚酶（3）制备2和3双脱氧的DDNTP。DNTP/DDNTP100/1（4）制备一小段单链引物（DNA或RNA）带有放射性或荧光标记批注不能有53和35的外切酶活性；与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。（高保真）。还有很多测序方法见PPT。留意自动测序。第二章基因工程的酶学基础一、II类限制性内切酶（1）识别位点48BP，回文结构（2）内切酶与识别序列的结合模式二聚体与靶序列结合（3）切割位点（识别位置处）切开双链DNA。形成粘性末端（STICKYEND）或平齐末端（BLUNTEND）。基因工程课程笔记创建于20141031第9页共35页缓冲液反应温度反应时间终止酶切的方法（4）粘性末端（STICKYENDS，COHENSIVEENDS）5端凸出（如ECORI切点）或3端凸出（如ECORI切点）（5）同尾酶ISOCAUDAMERS）识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BAMHI、BGL、BCLI、XHO等（同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。）DNA末端长度对限制酶切割的影响限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说在识别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否则限制酶将难以发挥切割活性位点偏爱（SITEPREFERENCE）某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。星号（）活性在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星号（）活性。酶切反应条件（1）缓冲液的化学组成MGCL2、NACL/KCL提供MG2和离子强度；RISHCL维持PH；二硫苏糖醇（DTT）保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等有助于酶的稳定；温度不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37OC，少数要求4065OC。反应时间反应时间通常为1小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量。终止酶切的方法EDTA加热苯酚EDTA可鏊合镁离子，从而可终止酶切反应，终止浓度为10MM；加热是常用的方法，对于最佳反应温度为37的酶，在65或80处理20分钟可使酶活性大部分丧失。对于在80作用20分钟也有不失活的酶可用苯酚抽提去除蛋白，或用试剂盒纯化DNA。完全消化与局部消化1）、完全消化内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。2）、局部消化只有有限数量的酶切位点被切开。影响限制性内切酶活性的因素外因外因是可预见和控制的，如反应条件、底物的纯度（是否有杂质、是否有盐酚的污染）、何时加酶、操作是否恰当、反应体积的选择以及反应时间的长短等等内因内因包括位点偏爱性、甲基化底物、底物的构象。构象的影响主要指切割线性DNA和超螺旋DNA时的活性，如与切割DNA相比，ECOR、PST、SAL需要至少2510倍的酶来切割PBR322的超螺旋DNA位点偏爱（SITEPREFERENCE）某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。二、连接酶基因工程课程笔记创建于20141031第10页共35页基因工程载体质粒型载体病毒型载体质粒病毒型载体人工染色体载体非接合型质粒接合型质粒拷贝数多松弛型质粒拷贝数少严紧型质粒人工构建的质粒载体的类型（1）高拷贝数的质粒载体（2）低拷贝数的质粒载体（3）失控的质粒载体（4）插入失活型质粒载体（5）正选择的质粒载体（6）表达型质粒载体两种DNA连接酶大肠杆菌连接酶T4噬菌体连接酶只能连接粘性末端。不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端。连接条件（1）必须是两条双链DNA（2）DNA3端有游离的OH，5端有一个磷酸基团（P）（3）需要能量连接反应的温度最佳温度为37度但实际温度为416度。（考虑到氢键的稳定性）影响连接反应的因素1、插入片段与载体的浓度比例（1020倍）增加机会。防止自连2、反应温度416三、修饰酶末端脱氧核苷酸转移酶用途1同聚物加尾给外源DNA片断和载体分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。（2）再生酶切位点（3）非放射性标记DNA片断的3端碱性磷酸酶分类（1）细菌性碱性磷酸酶（2）小牛肠碱性磷酸酶碱性磷酸酶的功能1）防止线性化的载体份子自我连接第三章基因工程的载体载体在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体基因工程对载体有哪些要求（1）在宿主细胞内能独立复制。（2）有选择性标记。（3）有一段多克隆位点。外源DNA插入其中不影响载体的复制。（4）分子量小，拷贝数多。（5）容易从宿主细胞中分离纯化。一、质粒型载体质粒（PLASMID）是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。质粒的类型（大肠杆菌中）质粒的复制类型基因工程课程笔记创建于20141031第11页共35页质粒的选择标记及其工作原理氨苄青霉素抗性（AMPR）卡那霉素抗性（KANR）四环素抗（TETR）链霉素抗性（STRR）氯霉素抗性（CMLR）有关质粒载体的构建天然质粒的局限性（1）分子量大，拷贝数低2）筛选标志不理想经典的大肠杆菌质粒载体1、PBR322（FBOLIVAR和RLRODRIGUEZ人工构建载体。）（1）元件来源复制起点ORIPMB1系列（来源于COLE1）的高拷贝型复制起点AMPR基因PSP2124质粒的AMPR基因TETR基因PSC101的TETR基因。（2）长度4363BP（3）选择标记氨苄青霉素和四环素抗性（4）克隆位点24个克隆位点（5）PBR322的优点双抗菌素抗性选择标记（没有获得载体的寄主细胞在AMP或TET中都死亡。获得载体的寄主细胞在AMP或TET其中之一中死亡。）分子小，克隆能力大高拷贝数氯霉素扩增后达到10003000拷贝安全失去了转移蛋白基因MOB（MOBILIZATION）。不能通过接合转移。3、PUC系列（UNIVERSITYOFCALIFORNIA的JMESSING和JVIERIA于1978年，在PBR322的基础上改造而成。属正选择载体。）（1）元件来源复制起点PBR322的ORIAMPR基因PBR322的AMPR基因LACZ的启动子大肠杆菌LACZ基因大肠杆菌LACZ的肽链序列，是LACZ的氨基端片断。（2）长度约27KB（3）克隆位点10个连续的单一限制酶切位点，位于LACZ基因的5端。（4）选择标记AMPICILLIN抗性和LACZ的肽互补（蓝白斑）相结合。蓝白斑选择原理XGAL半乳糖苷酶XGAL显色反应半乳糖苷酶能把无色的化合物XGAL分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5溴4氯靛蓝。基因工程课程笔记创建于20141031第12页共35页LACZ的肽互补1）肽（LACZ）半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（1141氨基酸）。LACZ只有在4聚体的状态下才有功能，受体菌基因组的半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解XGAL。PUC质粒载体上的LACZ编码肽与这个缺失突变的半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解XGAL。产生蓝色物质。PUC载体上LACZ的5端有一段多克隆位点MCS区，本身虽不干扰LACZ的合成，但插入外源基因就会阻止LACZ的合成。不能互补。IPTG的诱导作用IPTG是乳糖的类似物。能诱导LAC操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的LACZ的C端部分和载体的LACZ肽都表达。从而互补。但载体MCS上插入外源DNA后，仍然不能产生肽（5）PUC系列载体的优点更小的分子量选择方便克隆便利测序方便（PUC的MCS与M13噬菌体载体的MCS完全相同，便于把外源DNA转移到M13载体上测序。）由质粒载体演化而来的载体3穿梭质粒载体（SHUTTLEPLASMIDVECTORS）人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。穿梭载体的优点利用大肠杆菌进行基因克隆、表达也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达。可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。二、噬菌体型载体噬菌体（一类细菌病毒）的一般特性结构蛋白质外壳内包裹着DNA（双链、单链、线性、环状等）。噬菌体的生活周期1溶菌周期烈性噬菌体（VIRULENTPHAGE感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。2溶原周期温和噬菌体（TEMPERATEPHAGE感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化（LYSOGENIZATION（整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。）三、单链噬菌体载体单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体M13（典型）1单链DNA噬菌体的特点（1）DNA。（SSDNA）（2）复制型（RF）是双链环状DNA。基因工程课程笔记创建于20141031第13页共35页（3）RFDNA和SSDNA都能转染感受态大肠杆菌。并产生噬菌斑。（4）不存在包装限制。（5）可产生大量的含有外源DNA插入片断的单链分子，便于作探针或测序。2M13噬菌体（1）寄主M13噬菌体只感染雄性大肠杆菌。但M13DNA可以转染雌性大肠杆菌。（2）DNA长度6407BP（3）DNA提纯RFDSDNA在寄主细胞内以高拷贝形式存在。成熟的噬菌体里只包装有DNA，也容易提取。（4）M13的生活周期（5）没有包装限制包装过程3M13载体的构建（1）克隆区域的选定基因间隔区（INTERGENICREGION,IG区基因2与5之间507BP）（2）加入酶切位点4M13系列载体的优点（1）有MCS，便于克隆不同的酶切片段（2）XGAL显色反应，可供直接选择（3）无包装限制，克隆能力大（4）可以克隆双链DNA分子中的每一条链（双酶切）子代M13噬菌体中包含的是单连DNA。5M13载体的缺点插入外源DNA后，遗传稳定性显著下降实际克隆能力小于1500BP。虽无包装限制，并非无限包装6噬菌粒载体（PHAGEMIDVECTORS）由质粒载体与单链噬菌体载体的复制起点结合而成的新型载体系列。（1）噬菌粒载体的特点分子量小（3000BP）克隆能力大（可插入10KB外源基因）两种复制形式（既具有质粒的复制起点，又具有噬菌体的复制起点。既能在大肠杆菌中以质粒的形式双链复制，又能在噬菌体内进行单链复制。）2PUC118/PUC119构成1）M13的基因间隔区（带有M13的复制起点）（IG）2）PUC18/PUC19质粒载体质粒复制起点AMPRLACZMCSPUC118/119的复制模式1）双链质粒复制模式每个细胞500个拷贝2）单链滚环噬菌体复制模式基因工程课程笔记创建于20141031第14页共35页替换型载体半乳糖苷酶失活基因）不能进入溶源期（位点位于阻遏物合成区免疫功能失活型插入型载体CI噬菌粒载体的包装1）辅助噬菌体自身的复制起点发生了突变，复制效率低下，但感染细菌后能表达出外壳蛋白和复制蛋白，帮助噬菌粒载体复制。2）包装如右图（5）PCR产物克隆载体结构PUC的质粒部分、FI噬菌体ORI、KANR和AMPR抗性。特点MCS的中部已经切开，各有一个3端突出的T。PCR产物往往在3端突出一个A，所以能与这个载体直接连接。PROMEGA公司的T载体系列四、双链噬菌体载体载体1DNA分子的特点（1）长度为48502BP；（2）双链线性DNA；（3）但在两端有COS位点，可以环化。DNA两端各有12BP的粘性末端，粘性末端形成的双链互补区域称为COS位点2噬菌体的基因组特点DNA上有至少61个基因，有一半是必须的，与自身的活动有关，成簇排列。其他约1/3是非必须基因（位于尾部合成至阻遏之间的区段）。3DNA的复制模型1早期是型复制。晚期是（2）滚环复制形成多联体DAN分子。这种多联体分子必须在COS位点被切断成单体分子才能被包装起来。4噬菌体载体的构建（1）构建原理删除噬菌体的非必需区，留出插入空间。（2）构建过程在这个非必须区内制造限制酶切点引进某些突变表型，作为选择标记突变某些基因，使它成为安全载体删除DNA必须区段上常用的限制酶切点（3）人工构建的噬菌体载体有两种类型免疫功能失活插入导致载体不能合成阻遏物，载体DNA不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。没有外源DNA插入的载体感染受体菌形成混浊噬菌斑。替换型载体（SUBSTITUTIONVECTORS基因工程课程笔记创建于20141031第15页共35页（4）载体的筛选标记置换型载体可取代片断中如果包含LACZ，可用XGAL显色作筛选标记插入型载体根据插入所引起的表型突变5载体的体外包装DNA象质粒载体那样直接转化细菌时效率远比质粒低。（必须利用噬菌体外壳的作用）体外包装在试管中与噬菌体的头部和尾部蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染细菌，把重组DNA注入受体菌中。体外包装的容量限制必须在正常野生型容量的75105（3651KB）之间。野生型DNA的必须区是28KB，所以载体的最大克隆容量是23KB。（实际上为15KB）。（既不能超过正常野生型容量的5；又不能低于正常野生型容量的75）（4）DNA载体的优点比一般的质粒载体的容量大的多。用在真核生物基因组文库的建立。6COSMID载体（粘粒）1978年JCOLLINS和BHOHN等人发展出COSMIDVECTOR（COSSITECARRYINGPLASMID（1）大小46KB（2）组成一是DNACOS序列和控制包装的的序列。二是PBR322的质粒的复制子、抗药性基因、几个限制性酶的单一位点（3）COSMIDVECTOR的特点具有噬菌体的特性在寄主细胞内形成环化DNA（但不能形成新的噬菌体颗粒而溶菌）。克隆外源DNA后可以体外包装成噬菌体颗粒。具有质粒载体的特性大多带有PMB1或COLE1的复制子，能象质粒一样复制。方便的选择有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点。高容量的克隆能力45KB（最少不能低于30KB）。51KB5KB45KB（5）COSMIDCLONING应用COSMID载体在大肠杆菌中克隆大片端的真核基因组DNA技术，叫“柯斯克隆”（COSMIDCLONING）。理论依据COS位点包装识别。2“多联体”复制噬菌体的生命周期中，会产生数百个DNA通过COS位点连接的“多联体”分子。TER体系在包装的时候，噬菌体具有位点特异的末端酶（TERMINASE）体系（TER体系），识别COS位点，把多联体切成单个DNA长度。包装限制两个COS位点之间，必须保持3845KB的DNA，TER体系才能识别。（6）COSMID克隆的一般过程基因工程课程笔记创建于20141031第16页共35页克服载体自体连接的改良方案用碱性磷酸酶除去线性质粒片断5端的磷酸，可防止载体自体连接。高速搅拌超声波用特定的核酸内切酶消化真核生物DNA。用同样的内切酶消化COSMID载体。连接产物中将有一定比例的分子是两端各有一个COS位点、长度40KB左右的真核DNA与载体的连接物。TER体系识别并切割切割合适长度的杂种DNA连接物，并包装入噬菌体头部。感染大肠杆菌注入到细菌体内的杂种DNA分子环化，并按质粒的方式复制。（7）COSMID载体克隆的缺点载体片断自我连接。外源DNA片断自我连接。多个本来不在一起的外源DNA片断连接起来同时插入载体（8）COSMID载体的改良第四章目的基因的获取目的基因准备要分离、改造、扩增或表达的基因。第一节基因组DNA片断化用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。1优点由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。2缺点目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片二、随机片断化1限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。（1）限制性内切酶的选用原则内切酶识别位点的碱基数（4或6BP的概率不同）内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。2机械切割法第二节化学合成目的基因1976年HGKHORANA提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在SCIENCE上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸TRNA基因的论文。一、目前常用的方法磷酸二酯法、亚磷酸三酯法、磷酸三酯法、固相合成法、自动化合成法。1磷酸二酯法（1）原理保护DNTP的5端P或3端OH保证反应定向进行。带保护的单核苷酸连接带5保护的单核苷酸与带3保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。用酸或碱的脱保护2磷酸三酯法原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在3端磷酸和5OH上都先连接了一个保护基团。二、化学合成DNA片断的组装（化学合成的DNA片断一般在200BP以内。）1互补连接法（1）互补配对预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域形成有断点的完整双链。（2）5端磷酸化用T4多核苷酸激酶使各个片段的5端带上磷酸。（3）连接酶连成完整双链2互补延伸连接法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。右下图三、寡聚核苷酸化学合成的优点1直接合成基因2合成引物（20BP左右）3合成探针序列4定点突变合成（合成带有定点突变的基因片断。）5合成人工接头或衔接物第三节目的基因的保存和扩增基因工程课程笔记创建于20141031第17页共35页基因文库（GENELIBERARY）指在细菌中增殖来自某一生物的染色体DNA或CDNA所形成的全部DNA片段克隆集合体。基因库（GENEPOOL）天然存在于该生物物种体内的全部完整DNA序列的基因集合体。基因银行（GENEBANK）所有物种的DNA或CDNA或MRNA的序列都是经过测定的（称为基因组数据库更合适）。2构建基因文库的载体选用（载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。）（1）对载体的要求载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少（片断越大）。（2）目前常用的载体载体系列容量为24KP；COSMID载体容量为50KB；YAC容量为1MB。BAC容量为300KB3基因文库构建的一般步骤（1）染色体DNA大片段的制备断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。物理切割法超声波（300BP）或机械搅拌（8KB）。酶切法内切酶SAU3A进行局部消化。可得到1030KB的随机片断。（2）载体与基因组DNA大片段的连接（直接连接、人工接头或同聚物加尾。）4基因组文库的大小一个文库要包含99的基因组DNA时所需要的克隆数目。P文库包含了整个基因组DNA的概率（99）F插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数N所需的重组载体数（克隆数）记住书上的两个例子的算法二、CDNA文库的构建以MRNA为模板逆转录出的DNA称CDNA。CDNALIBRARY利用某种生物的总MRNA合成CDNA，再将这些CDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行繁殖、保存和扩增，称CDNA文库。3CDNA文库的特点（1）不含内含子序列。（2）可以在细菌中直接表达。（3）包含了所有编码蛋白质的基因。（4）比DNA文库小的多，容易构建。4构建CDNA文库的一般步骤（1）总RNA（TOTALRNA）提取（商业化的试剂盒）（2）MRNA的分离纯化1原理利用MRNA都含有一段POLYA尾巴，将MRNA从总RNA（RRNA、TRNA等）中分离纯化。MRNA只占总RNA的12。MRNA的分离纯化分离MRNA用商业化的OLIGODT纤维柱。（3）CDNA的合成CDNA第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。用OLIGODT（或随机引物）作引物，合成CDNA的第一链。降解MRNA模板用碱处理或用RNASEH降解MRNADNA杂交分子中的MRNA。CDNA第二链合成（很多方法见教材，大部分都造成缺失唯PCR不会）剩下的CDNA单链的3末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条CDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。去掉发卡结构用核酸酶S1可以切掉发卡结构（这会导致CDNA中有用的序列被切掉）。5CDNA与载体连接在双链CDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。或借助末端转移酶给载体和双链CDNA的3端分别加上几个C或G，成为粘性末端。6CDNA文库的大小一个CDNA文库要包含99的MRNA时所需要的克隆基因工程课程笔记创建于20141031第18页共35页真核细胞外源DNA原核细胞载体DNA重组分子表达扩增或表达数目。同样详情见教材三、文库的查询（SCREENING）用目的基因探针与文库中的重组载体进行SOUTHERNBLOT杂交。第四节目的基因的分离和扩增一、目的基因的分离1探针柱分离特异MRNA根据已知的基因序列合成探针，结合到纤维素柱上，用来分离纯化该基因的MRNA。2MRNA消解杂交原理羟磷灰石柱只结合单链DNA，不结合双链DNA。从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总MRNA。将表达A蛋白的MRNA合成CDNA第一链。再同不表达A的总MRNA杂交成CDNAMRNA双链。不能杂交的CDNA就包括特异表达的A基因的CDNA单链。用羟磷灰石柱收集单链CDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。二、PCR扩增获得目的基因1直接从基因组中扩增适合扩增原核生物基因（真核生物含有内含子）。（1）提取基因组DNA作模板（2）根据目的基因序列设计引物（3）PCR扩增2从MRNA中扩增RTPCR（适合扩增真核生物基因原核生物不易得到MRNA，也不含有POLYA尾。）1直接从基因组中扩增（1）提取基因组总RNA（2）反转录合成总CDNA作模板（3）根据目的基因序列设计引物（4）PCR扩增2从MRNA中扩增RTPCR（适合真核。原核生物不易得到MRNA，也不含有POLYA尾。）（1）提取基因组总RNA（2）反转录合成总CDNA作模板（3）根据目的基因序列设计引物（4）PCR扩增第五章基因的重组与转移第一节DNA片段的体外连接一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5端磷酸与3OH连到一起。二、齐平末端（BLUNTEND）的连接1直接连接5端与3端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1。2人工加尾形成“粘性末端”（1）同聚加尾法1原理DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3OH端加上脱氧核苷酸。基因工程课程笔记创建于20141031第19页共35页加尾碱基互补分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。（2）衔接物LINKER连接LINKER用化学合成法合成的一段1012BP的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。LINKER的作用用T4DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。优点1）可以用内切酶把插入片段切下来。2）能给载体连接上POLYLINKER缺点如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段（3）DNA接头ADAPTER连接法ADAPTER一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。ADAPTER的作用用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。缺点接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。可是不用担心先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5端的磷酸，防止自我连接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）三、PCR产物的连接1在引物的5端设计酶切位点（1）设计原则符合载体的多克隆位点；避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。（2）带酶切位点的引物的结构3端1520BP与模板互补；5端610BP是某个内切酶的识别序列。（5端多余的35BP属保护碱基）2与T载体直接连接（1）PCR产物两个3端一般都有一个A，TAQDNA聚合酶的特性在DNA双链的3端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。（2）T载体的两个3端人为地各加一个T，利用TAQDNA聚合酶，当原料中只有DTTP时，被迫在平端载体上添加T四、DNA体外连接应注意的事项基因工程课程笔记创建于20141031第20页共35页插入片断与载体的酶切位点互补DNA插入的方向正确（1）用双酶切插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入（2）起始密码（尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。）防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的5磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。五、载体和外源DNA插入片段的连接结果（见下页右上角）重组率的定义重组率含有外源DNA的重组分子数/载体分子总数在常规实验条件下，重组率一般为2575，重组率是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。第二节受体细胞一、什么是受体细胞（RECEPTORCELL）又称HOSTCELL，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定遗传的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。九大原则1、便于重组DNA分子的导入。2、能使重组DNA分子稳定的存在于细胞中3、便于重组体的筛选。4、遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长5、安全性高无致病性，不会对外界环境造成生物污染6、选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞。7、受体细胞在遗传密码的应用上无明显偏倚性8、具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达9、在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。原核细胞是较为理想的受体细胞原核生物细胞作为受体存在的缺陷真核细胞酵母菌基因工程课程笔记创建于20141031第21页共35页外源真核基因最理想的表达系统优势基因表达调控机理比较清楚；具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统；不含有特异性的病毒，不产生毒素；培养简单、利于大规模发酵生产，成本低廉；能将外源基因表达产物分泌至培养基中植物细胞优势具有全能性动物细胞优势能识别和除去外源真核基因中的内含子；真核生物蛋白翻译后能被正确加工或修饰；易被重组DNA质粒转染；可将表达产物分泌至培养基中缺点组织培养技术要求高第三节重组体导入受体细胞一、如何将重组DNA分子转入原核生物细胞什么是转化（TRANSFORMATION）重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。感受态（COMPETENT）能够吸收DNA的细胞细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA，并使其基因型和表型发生相应变化的能力。一、感受态大肠杆菌的制备1目的增加受体菌细胞膜的通透性。2菌种的选择；野生型的大肠杆菌并不是理想的受体细胞实验室常用菌株JM109，DH5，TOP10，DH10BHB1015、制备注意事项生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。必须在冰冷的条件下制备。CACL2处理要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。储存感受态菌要在70以下使用感受态菌时必须迅速融化（融化后一般不能再次冻存使用）3制备原理用CACL2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。基因工程课程笔记创建于20141031第22页共35页ONICE510MIN培养大肠杆菌4离心收集菌OD600至0304ONICE30MIN4离心收集菌用冰冷的60MMCACL2重悬4离心收集菌用冰冷的60MMCACL2重悬用冰冷的60MMCACL2重悬分装、70冻存（1）转化（TRANSFORMATION大肠杆菌捕获质粒DNA的过程（2）转染（TRANSFECTION大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。（3）转导（TRANSDUCTION借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。2转化率的定义转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。由于在一般的转化实验规模下，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率的定义也可以表征为每微克载体DNA转化后，受体细胞接纳DNA的个数，即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不长）转化率的用途利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模例如，某一DNA重组实验的重组率为20，转化率为107/G载体，经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104个重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验若重组率为100，则转化后产生104个重组克隆需要104/107X10201G载体DNA考虑到实验系统的重组率为20，所以实际投入载体应为01/2005G载体DNA载体投入量确定后，外源DNA的投入量即可按101的要求算出（5G），甚至还可以估算需要涂布多少块平板进行筛选3转化方法（1）热休克法（HEATSHOCK）（简单，但转化效率不高（106108/GDNA）。）（2）电转化法（转化效率高（高于109/GDNA）。）热休克法电转化法基因工程课程笔记创建于20141031第23页共35页4平板培养基培养细菌10100L转化液涂于含抗菌素的平板37过夜5影响转化率的因素（1）载体及DNA重组分子方面载体本身的性质不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同载体的空间构象质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级插入片段的大小对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低（2）受体细胞方面受体细胞必须与载体相匹配，例如PBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高（3）转化方法方面受体细胞的预处理影响最大、供受体的比例、转化方法6体外包装的噬菌体的转导（1）体外包装（INVITROPACKAGING）把重组的噬菌体DNA或COSMID质粒DNA包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。（2）转导（TRANSDUCTION）通过受体菌细胞表面的DNA接受器位点（RECEPTORSITE，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。（3）CI857基因突变的噬菌体CI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32下培养细菌时能够保持溶源性。但当温度升高到4445时，就会导致CI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。（但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。）基因工程课程笔记创建于20141031第24页共35页（4）互补型噬菌体在CI857基因突变的噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。噬菌体一、外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。噬菌体二、外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。包装过程如右图（6）转导体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每GDNA能形成106噬菌斑）。第四节外源基因导入真核细胞一、导入酵母细胞菌株选择转化率高的菌株；有突变的菌株（与导入的载体基因互补）；不育的菌株（不会与其他酵母接合）。2酵母的转化方法（1）利用原生质球进行转化（2）利用LI盐进行转化二、导入植物细胞1叶盘法（LEAFDISK）2电击法（ELECTROPORATION3基因基因工程课程笔记创建于20141031第25页共35页枪法（GENEGUN）4农杆菌（AGROBACTERIUM）介导三、导入哺乳动物细胞1磷酸钙沉淀法1原理HEPES缓冲盐水与含有氯化钙和DNA的溶液缓慢混合，会形成含磷酸钙和DNA的沉淀。（2）特点不需要载体。2脂质体（LIPOFECTIN）载体法脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。（脂质体有商业试剂盒）3显微注射法MICROINJECTION4DEAE葡萄糖传染法（二