《DNA重组技术》PPT课件

第四部分重组技术,的酶切、回收和连接转化,的酶切反应,分子生物学中经常使用的是II型限制性内切酶。它能识别双链分子中特定的靶序列（48bp),并在该序列内切断，形成特有的粘末端或平端。,一、实验目的,掌握酶切的基本原理。学习和了解限制性内切酶的使用方法。学习和掌握片段胶回收的方法,二、实验原理,1.核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一类专一识别双链中特定碱基序列的核酸水解酶，它们的功能类似于高等动物的免疫系统，用于抗击外来的侵袭。现已发现几百种限制性内切酶，它们以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的片段5端为P，3端为OH。由于限制性内切酶能识别特异序列并进行切割，因而在基因重组、序列分析、基因组甲基化分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技术中收到广泛应用。,三、试剂与器材,（一）试剂限制性内切酶；10内切酶缓冲液T4连接酶；10连接酶缓冲液电泳缓冲液1TAE琼脂糖；溴酚兰；溴化乙锭(工作浓度0.5g/ml)酚；氯仿；无水乙醇；70%乙醇；灭菌双蒸水,（二）实验器材1电泳仪、电泳槽、紫外检测仪、摄影设备2恒温水浴槽,四.操作步骤,酶切反应1.设计酶切体积为2030l，计算清楚酶切系统中各成分的用量，清晰做好记录，如果是同一条件下进行多个酶切反应，建议统一加好共同的组分后，分装；2.先加入正确体积的无菌双蒸水，加入1/10体积的10 x酶切缓冲液，混匀；3.在冰浴条件下加入适量的限制性内切酶；4.加入适量的样品；5.弹匀，短暂离心；,6.置所用限制性内切酶最适温度水浴中，酶切13小时，酶切过夜则建议改用稍大的酶切体积，以避免水分蒸发过多影响的酶切体系各组分浓度改变过大;7.置65水浴中10分钟，对限制性内切酶进行灭活，不同的酶灭活条件可能不同，请参照说明书进行;8.进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切反应的结果;9.反应体系：10内切酶缓冲液2l1-1.5g限制性内切酶2-5单位用灭菌的ddH2O补至20l，371小时。可根据需要按比例放大。,五.注意事项,影响限制性内切酶活性的生物因子：酶切割位点周围核苷酸两侧的碱基的性质；识别序列在中的分布频率；与的构象有关（SC,L,OC）；的纯度（蛋白、氯仿、SDS、EDTA、甘油等）；,内切酶用量不超过总反应体积的10%；消化时间适当延长有利于提高酶活性；加se-free的BSA可以起到稳定酶活性的作用；用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活性；酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可使用；样品应不含重金属离子,片段的胶回收,电泳洗脱法低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法冻融回收法玻璃奶回收法柱回收法（按说明书进行）胶回收后用30-50l无菌双蒸水洗脱片段，取1-5l进行电泳检测，取2-5l测定OD260下的光吸收值，计算的浓度。注：1OD260相当于双链浓度为50g/ml,胶回收注意事项,将电泳槽用ddH2O反复清洗干净,倒入新鲜配制的灭菌电极缓冲液；根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板；切胶时尽可能切掉不含片段的凝胶；要尽量减少在紫外下的照射时间以减少对的损伤；熔胶要完全。,的连接,在T4连接酶的作用下，平端或带有相同粘末端的分子可以连接上。连接酶的作分三步：T4连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物。酶-AMP复合物再结合到具有5-磷酸基和3羟基切口的分子上，使腺苷化。产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。,当我们已经获得目的基因片段，选择好适当的克隆（或表达，转化）质粒载体，并确定重组方案后，下面要进行的就是片段之间的体外连接，从而获得重组子。此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因工程药物的生产），还可用于序列分析和转基因等重要生物技术的研究中。,1、分子的体外连接,分子的体外连接就是在一定条件下，由连接酶催化两个双链片段组邻的端磷酸与端羟基之间形成磷酸酸脂键的生物化学过程，分子的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进行的。,连接反应中值得注意的几个问题：,1.连接酶常用的连接酶有两种：(1)来自大肠杆菌的连接酶(2)来自噬菌体的连接酶。二者的作用机理类似。,连接酶作用机制,连接酶作用分三步：.连接酶与辅助因子形成酶复合物。.酶复合物结合到具有磷酸基和羟基切口的上，使腺苷化。.产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来.,2.连接反应的温度,连接酶的最适反应温度为，但在此温度下，粘性末端的氢键结合很不稳定，折衷方法是过夜。,3.的平末端和粘性末端,由于内切酶产生的末端有平末端和粘性末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘性末端连接。二者连接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度选择上是有差异的，,4.碱性磷酸酶处理质粒载体,为了提高连接效率，一般采取提高的浓度，增加重组子比例。这样就会出现自生连接问题，为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其末端的磷酸基，防止环化，通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。,5.连接反应的检测,连接反应成功与否，最后的检测要通过下一步实验，转化宿主菌，阳性克隆的筛选来确定。我们下面的实验从粘性末端为例操作。,实验试剂,纯化后的酶切质粒载体和目的基因。连接酶buffer200mMTris-HCl(pH7.6)50mMMgCl250mM二硫苄糖醇500g/mlBSA连接酶5mMATP,实验方法,分子的体外连接在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：a.0.1g质粒载体，倍分子的外源。b.加无菌水至7.5l，于加温分钟使重新退火的粘端解链，将混合物冷却到。c.加入：连接酶buffer1l连接酶0.1l5mMATP1l盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心秒。下过夜连接反应。反应结束后于保存。,结果与分析,电泳检查连接结果：如何判断连接效果的成功性？,问题与讨论：,简述连接酶作用机理。简述一个完整外源的克隆过程。连接反应中应注意些什么问题及如何提高连接效率。,的转化及转化子的筛选,实验目的及背景：体外通过基因工程手段所构建的含目的基因的重组质粒，选用转化和筛选技术，可获得含重组的阳性克隆。在此阳性克隆中，可在生物体系中大量扩增，繁殖，保存以及表达目的基因的产物，这是体外扩增所不能替代的。配合重组技术，所获得的，不同目的需要的阳性菌株已广泛应用于科研，医药生产和生物发酵等领域。,制备感受态细胞,现在制备感受态细胞通常用CaCl2处理，在低温中与外来分子相混合.分子转化分以下几步:吸附双链分子吸附于受体菌表面；转入双链分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解；自稳外源质粒分子在细胞内复制成双链；表达供体基因随同复制子同时复制，分裂，转录翻译。,重组子的筛选,这和受体菌：质粒的选择相关，原则上要注意：受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌株；根据质粒基因型和受体菌基因型互补原则而定。重组子的筛选方法常用的有两种方法：,.抗生素筛选法,菌株为某种抗生缺陷型，而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素，卡拉霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。本实验利用抗生筛选转化子。,.互补法,现在使用的许多载体（如系列）有含有一个大肠杆菌的短区段，其中含有半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列和头个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。受体菌则含编码半乳糖苷酶端的序列。当外源基因插入时，二者溶为一体后，有半乳糖苷酶表达，在生色底物溴氯吲哚半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色菌落。而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。,实验试剂,培养基质粒（含Amp抗生基因），受体菌CaCl20.1MAmp,实验方法,一、感受态细胞制备将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，37培养1620小时。挑取单菌落转入20mlLB培养基锥瓶中，37振荡过夜。从中取ml菌液转入50ml培养基中37振荡培养45小时，测600达0.40.5。培养物于冰上分钟。转入50ml离心管，于4000rpm下4离心10分钟。弃上清，倒置离心管1分钟，流尽剩余残液然后加入10ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2，置冰上10分钟。4,000rpm4离心10分钟，弃上清。加入2ml，0.1MCaCl2悬浮细胞，于4过夜。,二、转化在.mlEppendorf管中加入l感受态细胞和l（ng）溶液，温和混匀，于冰上分钟。于水浴秒。冰浴分钟。加入lLB液体培养基分钟。取l涂布于含Amp(g/ml)琼脂