疫组化基本技术

免疫组化基本技术,主要内容一、实验的设计二、石蜡切片的脱蜡至水三、内源性酶的消除方法四、IHC的非特异性染色五、抗原的暴露和修复六、抗体的购置及注意事项七、抗体最佳稀释度的测定和保存八、显示系统及衬染剂的选择和配制九、IHC常用缓冲液,一、实验的设计1.查阅相关文献，列出要做的IHC指标，根据经费情况，选择相关公司购置特异性抗体和检测试剂。,2.列出IHC实验操作流程，选择何种IHC前处理方式。3.通过预实验寻找第一抗体的最佳稀释度，应设置何种对照。,4.每批实验应用同一稀释度的一抗，孵育时间和温度，同一的显色时间。5.列出阳性判定的标准6.预期达到的目标,组织与细胞材料的制备,1.手术切除标本的取材：抗原在组织中的分布常不均一，取材时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。组织大小：长1cm宽1cm厚0.20.3cm。,2.各种小组织的活检取材：它不仅体积小，取材困难，不易取到主要病灶，因此对标本的处理应特别慎重，及时固定，包埋时要平整。,一、组织取材注意事项1.组织要求离体后30min内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。,2.注意防止人为因素的影响刀和剪要快，刀要足够长。3.组织块的大小厚为0.10.3cm，大小可根据需要而定4.动物和人体组织的取材位置要视研究目的，观察部位而定,5.取材时间原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。,6.注意包埋方向7.边缘标记8.保持材料的清洁9.切除不需要的部分10.明确编号，登记11.骨组织还需脱钙,二、组织标本的固定1.目的(1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。(2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。,（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。（4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。,（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。（6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。,2.固定方法的选择及注意事项(1)大小2cm2cm0.3cm(2)及时固定,(3)固定时间固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。(4)组织固定后必须彻底冲洗。,三、组织脱水、浸蜡及包埋1.目的组织经固定和水洗后含大量水分,需用乙醇类试剂进行脱水,水脱完后,组织内含有大量的乙醇,还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换,最后经浸蜡,组织细胞内被大量石蜡支称,才使组织能用于石蜡切片。,2.脱水剂的种类：非石蜡溶剂的脱水剂和脱水兼石蜡溶剂的脱水剂。常用的脱水剂:(1)乙醇；(2)丙酮；(3)正丁醇；(4)淑丁醇；(5)环乙酮；(6)松脂醇；(7)二氧陆环。,3.常用的透明剂：(1)二甲苯；(2)甲苯；(3)苯；(4)香柏油；(5)苯甲酸甲酯；(6)氯仿；(7)冬青油;(8)苯胺油,4.原则脱水方法甚多，一般需逐级进行脱水，否则可引起组织强烈收缩，组织变形。在脱水完全的前提下，组织的透明必须彻底，但不能过长，否则会引起组织切片困难。,5.常规石蜡包埋过程(1)脱水：75、85乙醇，95、乙醇，无水乙醇、。(2)透明：二甲苯、二甲苯、二甲苯,(3)浸蜡：石蜡、石蜡、石蜡(4)石蜡包埋：修蜡块，标号,四、组织切片切片可分石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片，IHC切片要求不同与常规切片，需连续有序，防止脱片等特殊要求。,1.切片前的准备工作(1)载玻片的清洁：市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶。,(2)切片粘合剂的种类多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）：干净载玻片丙酮5minAPES（1ml+50ml丙酮）：用镊子夹住浸入APES试剂13次纯丙酮洗二次干燥玻片用铝箔包好，室温或4保存备用。,铬矾明胶液：铬矾0.5g明胶5gH2O21000ml甲醛明胶液：40甲醛2.5ml明胶0.5gH2O2100ml,2.切片要求及注意事项：(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。(2)5260烤片18h。(3)切片厚24m。(4)切片刀要快(5)编上号(6)切片可在4保存数年（石蜡切片）,石蜡切片脱蜡至水冰冻切片从-80取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。石蜡切片需经如下脱蜡才能做IHC。,二甲苯10min，二甲苯10min，二甲苯10min，无水乙醇2min，95乙醇2min，85乙醇2min，75乙醇2min，流水冲洗。,五、内源性酶的消除方法(一)内源性过氧化物酶的消除方法：1.0.3%3%H2O2甲醇液20min2.1H2O220min3.3苯肼溶液371h4.0.075%盐酸甲醇液30min,5.DAB-H2O2溶液中加0.005MNaN3过碘酸-硼酸钠：0.5%过碘酸10min，经洗后1硼酸钠处理10min。7.20mol/L-100mol/L抗坏血酸3060min。,(二)内源性碱性磷酸酶的消除方法1.10醋酸10min2.0.5mol/L碳酸氢钠（pH9.0）20min3.1mol/L左旋咪唑20min,(三)内源性生物素的消除方法1.用2-甲基-D苷露糖饱和生物素2.先用25g/ml卵白素孵育15min，PBS洗10min，移至生物素饱和液中处理15min，PBS洗15min。,六、酶消化和抗原修复1.为什么要进行酶消化和抗原修复？(1)固定液的影响自1893年FerdinandBlum创立组织固定以来，为了避免组织固定液对抗原决定簇的影响，已经寻找到几十种固定液，目的就是为了对一定抗原起到保护作用，同时还能获得良好的组织形态结构。,目前无一种固定液适用于所有的抗原，从组织细微结构的保存，稳定、简便和廉价综合评估上，甲醛最优。,甲醛使蛋白质发生凝固，自身和之间会发生交联，交联时会使蛋白质的四级和三级结构的折叠方向发生改变，使蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改变，而影响检测。(2)抗体制备的影响,2.酶消化(1)原理：1)去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白2)断交联,(2)蛋白酶的种类胰蛋白酶0.05%0.1胰蛋白酶加入等量的氯化钙，用0.1NNaoH调pH至7.8。消化时间3730min。,胃蛋白酶0.4%胃蛋白酶，用0.1NHCI稀释，消化时间3730180min。蛋白酶K20g/ml，用pH8.00.5MTris-HCI配制，消化时间372040min。,链酶蛋白酶0.1%，用pH7.4,0.5MTris-Hcl稀释，消化时间3714h。无花果蛋白酶0.1%浓度，用0.2MpH7.4PBS稀释，消化时间373060min。,(3)原则及注意事项胃蛋白酶和菠萝蛋白酶主要用于细胞间质抗原的检测前消化，其余蛋白酶均为细胞内抗原的显示消化。在配制和使用时应考虑到酶激活的最佳pH值，消化温度、浓度和孵育时间。,3.热诱导的抗原修复：抗原修复(AntigenRetrieval;AR)是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。,(1)依据：40年代美国学者Fraenkel-conrat等实验证实，甲醛和蛋白水解交联过程中氨基酸侧链上的某些基团(抗原决定簇)如咪唑、吲哚等基团受到影响，通过120高温或强碱处理后，可使交联打开。,(2)修复方式：微波9610min2；直接加温100，15min；水浴锅100，15min；高压锅/消毒锅120，5min；真空加热10min；直接烤片法。,(3)修复介质：0.01MpH6.0柠檬酸缓冲液(CB)；0.05mTris-HCL(pH1-12系列);0.01MpH7.0PBS;2%硫酸铝；2硝酸铝；生理盐水；蒸馏水。认为修复介质种类和溶液的摩尔浓度对修复效果影响较小，而pH值则影响较大。缓冲液以CB和Tris-HCL较常见。,(4)温度与修复时间的关系：许多的实验结果表明，温度高修复时间短，呈正相关。例如，Ki-67、P-gp的检测，利用同一切片，达到相同的染色结果如下步骤：10020min；9040min；8060min；7020h。(5)选择最佳的修复方法,(6)AR应注意的问题：高温AR因其机理尚不清楚，对某些存在的问题或现象不可能用设计对照的方法加以解决或解释清楚，例如，有些抗体在冰冻切片上不表达，或表达率很低，但石蜡切片用AR后，却能很好地表达；,某些应表达在胞浆或膜上的抗原，经过量修复后，绝大部分表达在核内；某些应表达在核内的抗原，经过量修复后出现在细胞浆内。因此对结果的判断要作出客观的分析。在操作过程中还应注意如下问题：,热处理后应注意自然冷却；热处理液不要让其煮干；不要任何抗原的检测都使用该方法；一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致；,形态学结构的改变：一般经高温修复后胞浆无明显的破坏，而对细胞核内影响较大，会出现核破裂，苏木素淡染等现象。如果在常用的修复液无法得到阳性结果，或经修复后抗原定位发生改变，可改用某些不常用的修复液，或加一些螯合剂，如EDTA和EGTA等可改善某些抗原的修复。,七、抗体的购置及注意事项1.抗体的购置目前商品化抗体已有上千种，一种抗体可以有数家公司生产，其质量的好坏也存在很大差异，首先应选择一家好的生产公司，根据文献提供的信息，选择所需试剂的型号。,2.购置抗体的注意事项(1)种属：单克隆抗体，多克隆抗体(2)能否用于石蜡切片(3)稀释度(4)特异性，交叉反应(5)用何种组织前处理形式(6)包装单位，价格,3.抗体的大致分类(1)癌基因与抗癌基因标记物；(2)细胞凋亡标记物；(3)各种信号传导标记物(4)各种正负调控基因标记物(5)细胞增殖及调控标记物；,(6)凝集素类标记物(7)激素受体标记物(8)病毒性标记物(9)各类肿瘤标记物(10)耐药基因标记物,八、抗体最佳稀释度的测定和保存1.直接测定法,一抗稀释度特异性染色非特异性染色1:50+1:100+1:200+1:400+1:500+()阴性对照()(),2.棋盘法,3.抗体稀释液抗体稀释液是从事IHC工作实验室必备，其制备方法如下：1克明胶(红、绿)溶在300ml0.2MpH7.6TBS中，加温，搅拌使其溶解，待其冷却后，加入1克牛血清白蛋白和100mgNaN3，4保存。,4.抗体的保存商品化一抗或自制一抗均需加入防腐剂，在4中保存一年其质量不会有太多的改变，如一次购置量大，可10l/支分装，标上号，-40保存备用。用抗体稀释液稀释一抗可在4中保存一年。,十、显示系统及衬染剂的选择和配制(一)显示系统目前用于IHC的标记酶主要有HRP，AKP，其显示系统分别为：,1.HRP常用的发色基因：(1)3、3-二氨基联苯胺盐酸盐(3、3-diaminbezidine;DAB);(2)3-氨基-9-乙基卡吧唑(3-amino-9-ethlylcarbazde;AEC);,(3)四甲基联苯胺；(4)盐酸对苯二胺；(5)4-氯-1-萘酚；(6)高香草酸(7)萘酚派若宁,2.AKP常用的发色基团：(1)BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸)NBT(硝基四氮唑蓝)；(2)萘酚AS-BI磷酸盐快红或快蓝。,3.配制方法(1)DAB:50mgDAB溶在0.01MpH7.6100mlTris-Hcl中，加入0.03%H2O2，显色812min，终产物为不溶性棕褐色颗粒状。,(2)AEC:取40mgAEC溶在5ml二甲基甲酰胺中，待完全溶解后，加入0.05mol/LpH5.5醋酸盐缓冲液50ml，最后加入0.03%H2O,终产物为红色可溶性。,(3)4-氯-萘酚：取100mg4cl-1-萘酚溶于10ml无水乙醇中，待完全溶解后加入0.05MpH7.6TB190ml,过滤后加入0.03%H2O2。,(二)衬染剂的选择和配制IHC染色后必须进行衬染，以衬托出组织形态结构，使形态与机能密切相关，以利于结果的分析。,1.苏木素衬染色剂(1)Mayer氏苏木素：取1gMayer氏苏木素加温溶于100ml蒸馏水中，再加入50g碘酸钠和50g钾明矾，溶解后加入枸橼酸和水合氯醛，溶解后过滤。,(2)Harris氏苏木素：取2.5gHarris氏苏木素溶于25m