体内药物分析方法

,体内药物分析,Biopharmaceuticalanalysis,第一章体内药物分析概述,一、体内药物分析的定义狭义：利用现代分析仪器和分离手段对人和动物血液、尿和组织等样品进行定性定量的分析广义：通过体内药物浓度的分析，了解药物在体内的数量和质量的变化，获得药代动力学参数，为药品的生产、临床应用作出评价,二、体内药物分析的意义,（一）在新药评价和开发中的意义1全面质量控制2新药报批3为设计新药提供信息从代谢产物中开发新药保泰松羟基保泰松（作用强、副作用小）非那西丁扑热息痛前药设计新剂型的研究，缓控释、经皮制剂等以上内容必须通过测定体内药物浓度得以解决,（二）临床合理用药中的意义1血药浓度与药理作用,2.影响血药浓度的因素,（1）机体因素a生理因素年龄、性别、生理状况b病理因素c遗传因素（2）药物因素a剂型因素（生物利用度问题）b药物合并使用（酶抑、酶促）c时间因素,（三）药物中毒解救的意义（四）兴奋剂检测的意义,三、体内药物分析的对象,3从样品的来源分,1从分析物分,母体药物代谢物内源性物质,2从生物样品种类分,均匀样品非均匀样品,人体实验动物,四、体内药物分析的任务,（一）方法学的研究（二）治疗药物监测TDM，therapeuticalDrugMonitoring1定义2哪些药物需进行体内血药浓度监测,有效血药浓度范围窄，稍高毒性大，稍低无疗效剂量小，毒性大的药物个体差异大，剂量难以控制药物毒性反应与疾病症状相似多种药物合并应用，有中毒危险胃肠道、肝脏、肾脏疾病呈非线性动力学的药物判断患者用药的依从性,（三）药代动力学的研究（四）代谢分型的应用（五）内源性物质测定,五、体内药物分析的特点,1干扰杂质多2样品浓度低3取样量少4工作量大5时间短6有一定设备,六、体内药物分析的发展,1国外发展概况60年代初发现药效与血药浓度关系70年代体内药物分析方法建立80年代至今发展迅猛，新仪器不断涌现书籍出版DrugLevelMonitoring1980TherapeuticalDrugMonitoring1981TextbookofBiopharmaceuticAnalysis1981,2国内情况,80年代初，药物分析工作者倡导，1980年版药物分析教材中纳入部分内容，第二、三版增加体内药物分析一章。第四版、第五版取消，各学校开设体内药物分析课程。80年代开始在医院进行临床药学工作，主要测定药物浓度。,有关书籍,吴如金体内药物分析人卫版1984陆明廉血药浓度测定与临床应用上海科技1986陈刚治疗药物监测理论与实践人民军医1988吴莱文治疗药物监测人卫版1989曾经泽生物药物分析北京大学出版社1998姚彤炜体内药物分析浙大2001张君仁体内药物分析化学工业出版社2002,3学科前沿,游离药物浓度测定直接进样方法研究代谢物测定对映体分析,第二章体内药物存在的状态与体内药物分析的关系,一、药物的体内变化吸收分布代谢排泄ADME过程发生两种变化物理变化可逆变化化学变化结构和数量发生变化,二、药物与血浆蛋白的结合,1游离型药物与结合型药物（非特异性的结合）在血浆、组织中均存在游离型和结合型的药物尿液中含微量P，血浆中含大量P，唾液中P为血浆1/10与药物结合的蛋白主要有白蛋白，a1-酸性糖蛋白、脂蛋白弱酸性药物主要与白蛋白结合弱碱性药物与白蛋白、a1-酸性糖蛋白结合药物与蛋白质的结合通过共价键（氢键，离子间静电力等）,2血浆蛋白结合率Df+PDbK=解离常数血浆蛋白结合率：=,PDf,Db,Db,Db+Df,1,1+K/np+Df/np,结合力强的药物可以置换结合力弱的药物，通过竞争蛋白是药物相互作用类型之一。由此可见，K、np是影响的重要因素npK药物在足够高浓度时使结合部位饱和，浓度再增高，多余的药物均呈游离状态，结合部分比率降低，药物血浆蛋白结合率是药代动力学的重要参数之一。,3血浆蛋白结合的测定平衡透析法、超滤法、凝胶过滤法、光谱法等。（1）平衡透析法原理计算=100%=Ct-Cf/Ct100%,袋内-袋外,袋内药物,注意事项,a.蛋白质溶液新鲜血浆pH7.4，至少三个浓度测定b.缓冲液0.13mol/L磷酸盐缓冲液，因为Na3PO4抑制酸性药物与蛋白质结合c.温度与平衡时间371648h注意防腐剂加入，药物的分解d.透析袋渗漏检测3%三氯醋酸e.搅拌保持动态平衡,影响因素,a.药物膜上吸附b.Donnan效应由于电荷的影响，可造成平衡时半透膜两侧游离药浓不同，donnan效应，加入中性盐可消除。c.空白值增加d.缓冲液体积变化，水分进入血浆游离药浓此法用于测定药物时，耗费时间太长，一般少采用,（2）超滤法,原理计算注意事项a装置50l5ml，选择不同型号超滤膜，保湿。b速度与时间300010000r/min515minc温度37，25，4影响因素a膜吸附b超滤液的体积超滤液/总体积0.30.6c超滤膜温度,三、药物与血浆蛋白结合对体内药物分析的影响,1血浆不同对体内药物分析的影响2平衡状态不同对体内药物分析的影响3平衡状态受破坏对体内药物分析的影响4游离与结合同时出现时对体内药物分析的影响,四、药物代谢,1研究药物代谢的意义了解药物在体内的命运及相互作用，保证临床用药安全有效研究药物代谢途径、药物结构与药理作用关系，寻找新药研究药物相互作用机制有利于建立体内药物分析新方法，避免代谢物干扰,2药物代谢的途径,第一相反应：在酶作用下发生的氧化、还原、水解，使极性增加，水溶性增强第二相反应：药物或经一相反应后的代谢物与葡萄糖醛酸、硫酸盐结合等，使分子极性进一步加大，有利于从尿中排出，结合过程通常使药物灭活。,氧化反应还原反应水解反应结合反应a葡萄糖醛酸结合b硫酸酯化c谷胱甘肽缀合d乙酰化结合e氨基酸结合,五、药物代谢与体内药物分析的关系,1样品的保存样品可能会分解，如血浆酯酶可使酯类药物水解，酶类可使药物继续代谢，加入酶抑制剂和冷藏保存。2分析方法选择光谱法色谱法免疫法3样品的提取、分离法代谢物极性大、水溶性强，pH缓冲系统分开尿液中药物多以结合型存在，要进行水解（酸水解、酶水解，溶剂解）,第三章生物样品的预处理,一、生物样品的采集与贮藏体内药物分析常用的分析品种有血液、尿液、唾液，也可用乳汁、泪液、脑脊液、胆汁等。,（一）样品的采集,1血样血样浓度与作用点的浓度密切相关，可以反映靶器官的浓度。,血细胞,血浆（plasma）,血小板,血清（serum）,血细胞,测定血样中平均分布于细胞内和细胞外的药浓,抗凝,自然,全血,血液,2尿样目的：药物剂量回收，药物清除，药物代谢和生物利用度特点：浓度高，易于收集，体内代谢研究，应水解分离3唾液唾液中药浓与血浓相关性收集方法离心收集,（二）样品的贮藏,1血样（血浆、血清）及时分离冷藏，-70加入稳定剂NaF2尿样尿中水、无机盐、尿素等细菌的生长，4保存加入防腐剂a1%甲苯b饱和氯仿cpH改变3唾液：同血样,二、生物样品的预处理,（一）预处理的目的存在形式的多样性游离结合代谢物浓度低，杂质多（分离浓缩）出现浑浊和沉淀与试剂起反应影响色谱柱寿命,（二）处理方法选择的一般原则,1药物理化性质pKa亲脂性挥发性溶解度光谱特征稳定性2浓度范围灵敏的方法3测定的目的定性定量母体代谢4生物样品的种类5样品处理与分析方法的选择专一性灵敏性,（三）生物样品去蛋白处理,1加入与水能混溶的有机溶剂及中性盐甲醇乙腈甲醇1:2乙腈1:1.5（NH4）2SO4NaCl2加入酸性沉淀剂三氯醋酸高氯酸苦味酸等使蛋白质分子的阳离子形成不溶性盐而，pH低于等电点,3组织酶消化法加入酶使蛋白质水解优点：平衡条件下进行，可避免反应和降解可改善对蛋白结合率强的药物的回收率不产生乳化4其他加热超滤,（四）生物样品缀合物水解,1酸水解2酶水解-葡萄糖醛酸苷酶芳基硫酸酯酶混合酶pH4.5-7.0373溶剂解某些药物的硫酸酯，往往加入率取溶剂时发生分解，同时提取有机溶剂中,（五）生物样品的萃取,1液-液萃取（1）优点：与杂质分离简便浓集提取率高（2）提取率：在有机相与水相中的溶解度的比值分配系数，一般少量多次，对生物样品一般一次萃取，70%重现性,（3）影响提取率的因素pH碱性药物在碱性pH酸性酸性pH提取溶剂相似相溶原理沸点低，不影响检测,性质稳定，不起化学反应离子强度加入中性盐增加离子强度，与水结合强，便于有机溶剂提取,（4）离子对提取,对于离子性特强，水溶性极大的药物，可采用离子对提取原理应用阴离子：COOH+SO3H-反离子四丁基铵阳离子：NH2+反离子烷基或芳基磺酸盐（5）提取技术一般在试管中进行有机相与水相比1:1或2:1,（6）乳化问题措施轻缓振摇含有分散度大或不溶物应过滤掉避免在高pH条件下，从水中提取药物避免使用易发生乳化的溶剂萃取剂水中加入少量NaCl,破孔方法机械法加入少量高级脂肪醇改变表面张力改善混合溶剂比例，增加分散相分数,（7）药物的吸附玻璃容器吸附1%三甲一氯硅烷10%二甲二氯硅烷血浆,2液固萃取,固相萃取solidphaseextractionSPE针管式抽空减压加压过滤,（1）固相萃取步骤,固相选择样品1ml1ml规格固相125ml3ml规格固相固相处理反相C18固定相的610倍体积甲醇洗柱，使溶剂化610倍水缓冲服液冲洗达分离状态上样分离用适当的弱溶剂洗涤洗去杂质，通N2干燥固相洗脱待测物改变pH或极性,（2）影响固相萃取的因素,（1）流速流速快，按触不充分，样品流失回收率低柱处理510mlmin-1洗脱0.21mlmin-1（300mg25mlmin-1（300mg）（2）装样过载突破性试验已知浓度样品液小体积上柱洗脱回收百分率加大体积洗脱回收百分率绘图当回收率下降时为过载,（六）生物样品的组分浓集（七）衍生化处理GC衍生化HPLC衍生化,第四章体内药物分析方法的建立与评价,一、分析方法,根据药物理化性质，结构特征，药物浓度，干扰成分大小，实验目的,二、分析方法的设计依据,方法的建立,原始方法改进创新创立方法,1做好文献总结2充分了解药物特征及体内状况pH、亲脂性、溶解度、极性、光谱特征、药动学参数、体内代谢情况3明确测定目的、要求目的4结合实验室条件设备条件预处理方法,药浓监测药代动力学研究母体药物和代谢物,三、分析方法的建立,1纯品进行测定确定线性范围、灵敏度、反应条件（pH、t、T）2空白样品测定确定空白样品是否有干扰3以水代替空白样品，加标准液后测定了解提取率、检测浓度确定萃取条件、pH、挥发浓缩等4空白样品加入标准液测定标准曲线建立回归方程回收率5实验样品测定,四、分析方法的评价,可行性和可靠性1准确度accuracy测定结果与真实性的差异用回收率表示接近100%相对恒定,绝对回收率也称萃取回收率、提取回收率测定血浆样品中药物浓度/相同浓度的标准液=绝对回收率考虑3个浓度（高、中、低）分布在标准曲线成上、中、下一般要求绝对回收率在70%一般方法HPLC内标内标法时注意：药物与内标用各自外标法测定回收率应相近，差值10%,相对回收率方法回收率药物系列浓度+血样标准曲线取高、中、低三浓度加入到空白血浆中，处理后测定，与加入标准量相比，得方法回收率，测定值15%，定量限20%,注意问题：a加入药量与实际测定值相近b加入物与实际存在状态相近c空白试验与已确定方法进行比较,2精密度precision,标准差SD相对标准性偏差RSD不大于15%，定量限不大于20%日间精密度日内精密度,3灵敏度（sensitivity）检测的最小量,（1）检测限（LOD）从背景中检测到的最小药物浓度：S/N3的绝对量LOD=3N/S（N噪间S被测物信号/单位重量）N=1mm取2gml样品，20l进样峰度30mmLOD=4ng,（2）定量限(LOQ)在一定精密度和准确度前提下求得最低检测量，通常以标准曲线最低点作为一定量限，也可S/N=10作为定量限，实际测定时，满足35个半衰期浓度，或Cmax1/101/20,（3）最低检测浓度可以进行定量测定的某一药物的最低浓度，它与样品体积大小等因