普通显微镜PPT课件

.,1,显微镜技术,张文海海洋大学水产与生命学院,.,2,主要内容,一、显微镜的发展二、显微镜的应用三、显微镜的原理四、显微镜的结构五、显微镜的重要参数六、显微镜的镜头七、显微镜的像差,.,3,一、显微镜的发展,.,4,显微镜理论、制作和应用的发展从十五世纪开始逐渐发展起来的。,.,5,近代光学显微镜的发展历程,1590年，荷兰的詹森父子(HansandzachriasJanssen)制造出第一台原始的、放大倍数约为20倍的显微镜这个显微镜是用一个凹镜和一个凸镜做成的，制作水平还很低。发明的偶然性詹森父子俩的修养起了决定作用，他们抓住这个偶然的发现，认真思索，反复实践，用大大小小的凸玻璃片做各种距离不等的配合，终于发明了世界上第一台显微镜。并没有发现显微镜的真正价值。也许正是因为这个原因，詹森的发明并没有引起世人的重视。,.,6,16l0年，意大利物理学家伽利略(Galileo)制造了具有物镜、目镜及镜筒的望远镜,.,7,1665年，英国物理学家罗伯特胡克(RobertHooke)用复式显微镜观察软木塞时发现了小的蜂房状结构，称为“细胞”，由此引起了细胞研究的热潮。,.,8,（左）1665年R.Hoock用来发现细胞的光学显微镜。,(右)1848年的显微镜。,.,9,近代光学显微镜的发展历程,荷兰的显微镜学家、微生物学的开拓者列文虎克(A.vanLeeuwenhoek)首先制造成放大275倍的显微镜，并于1673年，描述了哺乳动物红血球的观察情况，1677年，又发现了人以及狗和兔子的精子,.,10,MadebyA.vanLeeuwenhoek(1632-1723).Magnificationrangesat50-275x.,.,11,近代光学显微镜的发展历程,1684年，荷兰物理学家惠更斯(Huygens)设计并制造出双透镜目镜惠更斯目镜，是现代多种目镜的原型。这时的光学显微镜已初具现代显微镜的基本结构,惠更斯目镜有两片凸面朝向显微物镜的内焦点平凸透镜构成,该结构不能消场曲,由像散来平衡,一般用于低倍显微镜;,.,12,1752年，英国人J.Dollond发明消色差显微镜。1812年，苏格兰人D.Brewster发明油浸物镜，改进了体视显微镜。,1840年法国光学仪器商人查尔斯塞福尔制造的显微镜MicroscopemadebyCharlesChevalier1840,.,13,在显微镜的发展史中，贡献最为卓著的是德国的物理学家、数学家和光学大师恩斯特阿贝(ErnstAbbe)。他提出了显微镜的完善理论，阐明了成像原理、数值孔径等问题，在1870年发表了有关放大理论的重要文章。两年后又发明了油浸物镜，并在光学玻璃、显微镜的设计和改进等方向取得了光辉的业绩。,.,14,Bausch在物镜筒壁上常注有主要性能指标放大倍数、镜口率等;,目镜:是由上面的接目透镜和下面的会聚透镜二部分组成的,两者之间装有一个光阑;,光学放大系统:,.,38,镜座是显微镜的基座,用以支持整个显微镜,其内常装有照明光源和反射镜;镜臂是显微镜的主要支架,用以支持镜筒、载物台、聚光器和调焦装置等;载物台又称镜台,中央有一个通光孔,确保光线与台面垂直通过。镜筒位于镜臂的上部,其上端放置目镜,下端连接物镜转换器;调焦装置包括较大的粗准焦螺旋和较小的细准焦螺旋;物镜转换器等,机械装置：用于固定材料和观察方便,包括:,.,39,.,40,.,41,五、显微镜的重要参数,.,42,显微镜的重要参数,分辨率放大率和有效放大率数值孔径焦深视场宽度复盖差工作距离图像亮度视场亮度,合理使用参数各项参数并不都是越高越好，在使用时，应根据镜检的目的和实际情况来协调各参数之间的关系，以保证分辨率为准。,.,43,分辨率（Resolution）又称“鉴别率”、“解象力”和“分辨本领”.是指将邻近两点清晰区分辨认的能力。是衡量显微镜性能的又一个重要技术参数。分辨本领：德国著名理论光学家Abbe早在100多年前就给出分辨本领：R=0.61/nSin，n为物体所处媒介的折射率；为孔径角；为发射光波长。,.,44,衍射的形成,物理光学把光视为一种电磁波，具有波粒二象性，即波动性和粒子性。由于光具有波动性质，使得光波相互之间发生干涉作用，产生衍射现象。,.,45,狭缝实验,屏幕上的P1点到狭峰上边缘的距离和它到狭峰下边缘的距离之差为一个波长。从狭峰上缘和从狭峰下缘发出的两列光波在P1点相互影响。整个狭峰内发出的光波的累计相干效果，是在P1点两侧造成一个光强的低谷，P1点位于谷底位置。相反，在P2点处，从狭缝上缘和下缘发出的光波的波程差1个波长，P2成为相干增强区的中心，称为第一级衍射极大值。,.,46,衍射结果,点光源通过透镜产生的埃利斑第一暗环半径式中n为介质折射率，照明光波长，透镜孔径半角，说明埃利斑半径与照明光源波长成正比，与透镜数值孔径成反比,由斑点光源衍射形成的埃利斑（a）及其光强分布图（b）,衍射使物体上的一个点在成像的时候不会是一个点，而是一个衍射光斑。如果两个衍射光斑靠得太近，它们将无法被区分开来。,.,47,瑞利判据：两埃利斑中心间距等于第一暗环半径R,.,48,阿贝成像原理,对于周期性结构的物体，图像的形成用阿贝成像原理来解释。光线通过细小的网孔时要发生衍射，衍射光线向各个方向传播，凡是光程差满足k=0，1，2，的，互相加强。同一方向的衍射光则成为平行光束。平行光束通过物镜在后焦面上会聚；形成衍射花样。衍射花样上的某个衍射斑点是由不同物点的同级衍射光相干加强形成的；同一物点上的光由于衍射分解，对许多衍射斑点有贡献。从同一物点发出的各级衍射光，在产生相应的衍射斑点后继续传播，在象平面上又相互干涉，形成物象,.,49,阿贝成像原理,阿贝成像原理可以简单地描述为两次干涉作用：平行光束受到有周期性特征物体的散射作用形成衍射谱，各级衍射波通过干涉重新在像平面上形成反映物的特征的像。,.,50,物与象之间的相似性,物象是由直射光和衍射光互相干涉形成的，不让衍射光通过就不能成象，参与成象的衍射斑点愈多，则物象与物体的相似性愈好。,.,51,分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。R=0.61/NA为入射光线波长；NA为镜口率sin，n=介质折射率；=镜口角/2（样品对物镜镜口的张角/2）思考：如何提高显微镜的分辨能力？,肉眼：0.2mm;光镜：0.2um;电镜：0.2nm,.,52,对可见光（波长为400700nm）来说，能清楚分辨出相邻两点之间的最小间隔为0.2m。R0.61/n.sina0.610.5m/1.510.2m,表:几种介质的折射率,.,53,显微镜的几个光学特点：分辨本领是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定，NA值越大，照明光线波长越短，分辨率就越高。介质折射率越接近镜头玻璃的（1.7）越好；sin的最大值小于1；介质为空气，镜口率一般为0.050.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。,.,54,放大率的概念放大率即为放大倍数,是指被捡物镜经物体放大再经目镜放大后，人眼所看到的最终图象的大小对原物体大小的比值。是物镜和目镜放大倍数的乘积。是指长度的放大，而不是指面积的放大。物镜和目镜的放大倍数均标刻在其外壳上。总放大率(M)物镜放大率(Mob)x目镜放大率(Moc),放大倍数物镜倍数*目镜倍数,.,55,有效放大率把由显微镜的分辨本领所能分辨开的两点间的距离，放大成相当于人眼能分辨的距离。人眼的分辨本领大致为0.1mm,所以分辨本领为0.2m的显微镜，其有效放大率是0.11000/0.2=500倍。无效放大率当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。显微镜观察物体时，把物体的像放大到超过肉眼已能详细辨认细节的程度是没有必要的。,.,56,普通光镜分辨力约为0.2m，人眼的分辨力为0.1mm，因此,光学显微镜的有效放大倍数为0.1mm/200nm=500倍左右在实际使用时,为了操作上的方便,不应使眼睛经常处于最高分辨而容易疲劳的状态,用分辨本领大致是0.1mm的肉眼来观察0.2-0.3mm的细节就毫不费力,因此,常把上面定义的有效放大倍数再提高1-2倍，认为光学显微镜的有效放大倍数约为1000-1500倍,.,57,物镜与目镜的合理使用观察时应在有效放大率的范围内来选择。使用100X的物镜时，应使用6.7X或10X的目镜较好，如用5X目镜则达不到人眼所能分辨的大小；用20X的目镜则为无效放大。在观察时，一般使用10X的目镜为好，愈是高级的研究用显微镜常配置二对10X的目镜，10X目镜为“标准目镜”。作高倍镜捡时，首先应考虑更换物镜，而不要盲目更换过高倍率的目镜。,.,58,两组物镜与目镜配合使用比较20X（物镜0.40NA）与20X（目镜）搭配使用图象质量欠佳40X（物镜0.65NA）与10X（目镜）搭配使用图象质量优良中间镜在研究用显微镜中，目镜与物镜之间若有中间镜，则总放大率应再乘以中间镜的放大倍数。,.,59,数值孔径（NA）又称“镜口率”、“开口率”，简写NA或A。是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断其性能高低的重要标志。数值的大小分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上。数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（n）和半孔径角（）的正弦之乘积。NA=nsin物镜的数值孔径（NA）一般在0.85-1.4之间。,.,60,孔径角是物镜光轴上的物点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，分辨率越高。孔径角与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。根据阿贝成像原理，衍射光线反映了物体形貌的细节，因此一个物镜要反映物体的细节，必须能够接受尽量多的高阶衍射光线。物镜接收衍射光线的能力也强烈的依赖于在样品与镜头之间的介质。因此，数值孔径的概念更加能够有效的描述物镜的成像能力。,.,61,数值孔径N.A（n.sin）,数值孔径的大小代表了光镜的会聚能力。数值孔径越高，光镜的分辨力越大，所呈影像的亮度越强。,.,62,常见物镜的数值孔径如下表：物镜数值孔径(N.A.)工作距离(mm)100.255.40400.650.391001.300.11,.,63,焦深焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体点时，不仅位于该点平面上的各点都可看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清晰部分的厚度就是焦深。焦深大，可看到被检物体的全层，而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层。焦深与总放大倍率及物镜的数值孔径值成反比。放大倍率愈高，数值孔径值愈大，焦深则愈小。,.,64,视场直径也称视场宽度或视场范围，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围。视场直径大小是由目镜里的视场光阑所限定。视场直径愈大，愈便于观察。使用广角目镜可以增大视场直径。增大物镜的倍率，视场直径减小。,.,65,复盖差由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了象差，这就是复盖差。复盖差的产生影响了显微镜的成象质量。盖玻片的标准厚度为0.17mm，允许范围在0.160.18mm。物镜外壳上标刻的0.17，即表明该物镜所要求盖玻片的厚度。低倍物镜不受盖玻片影响，使用油镜时盖玻片不能太厚。,.,66,镜象亮度与视场亮度镜象亮度是显微镜的图像亮度的简称，指在显微镜下所观察到图象的明暗程度。使用时，对镜象亮度的要求，一般是使眼睛既不感到暗淡，又不耀眼，使眼睛不感到疲劳为好。镜象亮度对于在高倍镜下观察和显微摄影及投影时尤为重要，如果没有足够的镜象亮度，显微照相要延长曝光时间，显微投影屏上的图象也因暗淡，从而影响观察。,.,67,明视距离最适合正常眼细致观察物体又不易产生疲劳感觉的距离。一般人的明视距离为2030厘米。在设计光学仪器时，目镜成像的位置一般规定为25厘米。放大镜和显微镜目镜的角放大率也是以像距为25厘米、物距接近焦距f来计算的。,.,68,工作距离工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离，它与焦距是两个概念。调焦实际上是调节工作距离。物镜倍数小，其工作距离长；反之，孔径大的高倍物镜，其工作距离短。研究用显微镜的物镜前透镜处带有弹簧装置，显微镜的机械部分也加有“限位装置”。倒置显微镜其工作距离可达14mm，体视显微镜的工作距离可达20mm。,.,69,高低倍物镜工作距离的比较,.,70,六、显微镜的镜头,.,71,人的视觉：人类从客观世界获得的信息90%来自于视觉。但人的视觉是有限的。空间分辨能力、时间分辨能力、光谱响应范围、强度感受能力。光学仪器：为了提高人的视觉能力，借助于光学仪器：平面镜、球面镜、透镜等组成。,.,72,人的眼睛,瞳孔,.,73,助视仪器的放大本领,.,74,放大镜（凸透镜）放大倍数通常用“”表示，如放大3倍，为“3”。,.,75,显微镜的放大本领,最简单的显微镜是由两组透镜构成的：物镜（焦距很短），目镜（惠更斯目镜）。显微镜的光路图,.,76,物镜物镜是显微镜最重要的光学部件，物镜最前面的透镜称“前透镜”，最后面的透镜称后透镜”。物镜复合透镜组的总焦距为物镜的焦距。物镜前透镜与被检物体之间的距离称为工作距离。在高倍镜检时，为了防止压碎玻片和损伤物镜，除物镜的前端装有弹簧装置外，低倍至高倍物镜必须齐焦。,.,77,.,78,干燥系物镜即放大率为1,2,4,10,20,40,60X的物镜。镜检时物镜前透镜与盖玻片之间以空气（n1）为介质。油浸系物镜即放大率为90、100X油镜。镜检时物镜前透镜与盖玻片之间以香柏油、无荧光油（n1.5左右）为介质。该类镜物外壳上常标刻有“Oil”、“IL”或“HI”字样。,.,79,平场物镜平场消色差物镜在镜头的外壳上标有P1anACF。平场复消色差物镜在镜头的外壳上标有P1anAFO。平场半复消色差物镜外壳上标刻有P1anSAO。超平场复消色差物镜外壳上标刻有SP1anSAO。特种物镜带校正环物镜校正由盖玻片厚度不标准所引起的复盖差。带虹彩光阑物镜在物镜镜筒内的上部装有虹彩光阑，增大焦深的作用。,.,80,相衬物镜用于相衬镜检术的专用物镜，其特点是在物镜的后焦点平面处装有相板。无荧光物镜专用于落射式荧光显微镜上的物镜，这种物镜即使受到很强的激励光源也不发出荧光。“UV、FL”字样作为标志。长工作距离物镜是倒置显微镜的专用物镜。,.,81,目镜,作用：目镜的作用是把物镜放大的实象（中间象）再放大一次，并把物象映入观察者的眼中，实质上目镜就是一个放大镜。构成：由不相接触的两个薄透镜组成。设计：放大本领；矫正像差；配备分划板（提高测量精度）；使倒立像变成正立像。,.,82,两种常见目镜（1）惠更斯目镜：两个同种玻璃的平凸透镜组成，凸面都向着物镜。这是最常应用的一种目镜，被广泛地用于普通生物显微镜上，不能满足高级研究镜检的要求。,.,83,（2）冉斯登目镜：由两块平凸透镜相隔一定距离组成，两块透镜的凸面相对，这比惠更斯目镜优越，便于观察。注意：共同点：对被观察的实像都有放大作用。不同点：前者只能观察实像，后者还可以观察物；后者能对物或像进行长度测量，前者则不能。,.,84,.,85,凯尔勒目镜接目镜是由两片透镜胶合而成，是一种消色差的目镜，图象质量进一步得到改善。平场目镜增加了一块负透镜，能校正场曲的缺陷，而使视场平坦。在目镜的外侧或端面常标刻“P1an”或“P”字样，适用于观察和显微相照。广视场目镜由多片透镜构成，在研究用显微镜中多为此种目镜。标刻有“W”或“WF”和WHK字样。在高档研究用显微镜上，有的还配置超广视场目镜，视场范围更大，更便于观察，目镜外侧标有“SWK”字样。,特殊目镜,.,86,照相目镜专供显微照相和投影之用，不能用于观察。它的特点是视场平坦，可校正物镜的残留色差，放大倍率一般在2.5X6.7X之间不等倍率的目镜。其它目镜有比较目镜、投影目镜、指示目镜、测微目镜及网格目镜等这些目镜是作为显微镜的一种附件，专用于某项特殊的用途。,.,87,光阑所有光学元件的边缘和特加的有一定形状的开孔的屏统称为光阑，它们在光学系统中起限制光束的作用。,.,88,在光学系统中，不论是限制成像光束的光孔，或者是限制成像范围的光孔或框，都统称为“光阑”。按其作用的不同，分为孔径光阑和视场光阑两种。孔径光阑为限制入射光束大小的孔，其大小和位置对透镜所成像的清晰程度、正确性和亮度都有决定性的作用。如照相机镜头上的圆形光阑（俗称光圈）。视场光阑是限制成像景物的面积大小（视场）所用的孔。例如照相系统中的底片框。例如：显微镜的遮光器又叫做光阑,.,89,显微镜的两种可变光阑，即孔径光阑和视场光阑。视场光阑的调节使用：视场光阑位于镜座之中，其作用：一是根据物镜的倍率给予不同直径的光束面积二是在显微摄影时起着增减影象反差的作用。当光扩大到一定程度，照射到标本上的光即会有反射与不规则的散射，造成影象反差的损失。当视场光阑收缩到取景框边缘外的时候，摄影图象的反差就会改进。如果视场光阑收缩得过于接近取景框，图象的四角将被切去。因此，视场光阑应比取景框稍大些。,.,90,安装在聚光镜中的光阑叫孔径光阑。它的作用是使图象的分辨率、反差和焦深处在最佳状态。大多数的标本，如想得到高质量的照片，孔径光阑要调节在物镜数值孔径的60%80%之间(见右上图)。在显微摄影时，通常用缩小孔径光阑方法来提高影象反差。视场光阑随孔径光阑而变，总是外切孔径光阑。,.,91,孔径光阑的功能孔径光阑放大，照片反差变小。孔径光阑收缩过小，照片反差增大，但分辨率变小。孔径光阑收缩不得低于物镜数值孔径的60%。,.,92,光阑消除畸变,.,93,聚光镜弥补光量的不足和适当改变从光源射来的光线性质，将光线聚焦于被检物体上，以得到最强的照明光线。聚光镜的结构形式类型阿贝聚光镜由两片透镜组成，有着较好的聚光能力，多用于普通显微镜上。消色差等光程聚光镜由一系列透镜组成（5、7片），是明场镜检中质量最高的一种聚光镜，高级研究用显微镜配用。,.,94,摇出式聚光镜在低倍物镜时(如4X)使用，数值孔径可从0.16-0.90改变。极低倍聚光镜与极低倍物镜(如1X、2x)配合使用的聚光镜，其数值孔径最大值为016。其它聚光镜暗场聚光镜、相衬聚光镜、偏光聚光镜,.,95,.,96,照明装置透射式照明又称反射式照朋，分中心照明和斜射照明两种形式，适用于透明或半透明的被检物体，落射式照明适用于非透明的被检物体。中心照明是最常用的透射式照明法又分为“临界照明”和“柯勒照明”两种。,.,97,临界照明普通的照明法，不适用于显微照相。,.,98,柯勒照明这种照明的热焦点不在被捡物体的平面处，即使长时间的照明，也不致损伤被捡物体。是成功进行显微照相必须的一种照明法，在视场内看不到灯丝的象，使照明变得均匀。观察时，应把视场光阑开启到视场周缘的外切处，使不在物镜视场内的物体得不到任何光线的照明，避免散射光的干扰。,.,99,斜射照明这种照明光束的中轴与显微镜的光轴不在一直线上，而是与光轴形成某种角度斜射照射到被检物体上。又可分为：明场斜射照明光束经聚光镜后，斜射被检物体而进入物镜如相衬显微术。暗场斜射照明光束是以更大的倾斜度射向被检物体后不直接进入物镜，而由物体表面所反射和衍射的光线进入物镜如暗视野显微术。,.,100,落射式照明又称“反射式”或“垂直式”照明。这种照明的光束来自物体的上方，通过物镜后射到被检物上，这样物镜又起着聚光镜的作用。适用于非透明物体，如金属、矿物以及大而厚的生物样品的镜检。在高级荧光显微镜及大型研究用显微镜中，除透射照明装置外，还设有落射照明装置。体视显微镜的落射照明是利用自然光或照明灯具由侧上方斜向照射被检物体。,.,101,显微镜的光轴调节在显微镜的光学系统中，光源、聚光镜、物镜和目镜的光轴以及光阑的中心必须与显微镜的光轴同在一直线上。,.,102,聚光镜数值孔径（NA）一般在0.05-1.4范围内变化，它可通过调节孔径光阑的大小来改变NA值的大小，从而达到与物镜NA值相匹配。有的聚光镜可以把上透镜推出光路，NA值则下降。聚光镜的正确使用在观察时，聚光镜的NA值应等于或略大于物镜的NA值；在显微照相时，则应小于物镜的NA值。,.,103,七、显微镜的像差,.,104,。,透镜的成象质量透镜所形成的象除了象的位置、大小、倒正、虚实之外还有成象的质量问题，也就是说，物体通过透镜后所成的象与理想象上的差异。所产生的象差将直接影响显微镜成象的清晰度和象的变形。透镜所形成的象，应满足几何相似的要求点的象应为一点直线的象应为一直线平面的象应为一平面,.,105,影响透镜成象质量的因素从一点发出的光束在通过透镜后，光束的同心性或多或少地受到破坏（由光具有的物理性质及使用的光源的特点以及光具的制作技术而造成），在象空间并不相交于一点，而是分布在一个很小的区域内，所形成的象与理想象在形状、颜色上有着一定的差异，这种差异称为“象差”（Aberration）。,.,106,.,107,一、球面像差二、彗形像差三、像散四、像面弯曲五、畸变,.,108,一、球面像差（球差）,形状：弥漫圆斑。成因：主要是由于透镜表面为球面所造成的。大小：通过透镜的光线与主轴最近（最远）的交点和理想像点之间的距离。球差的大小与透镜表面曲率半径r、折射率n、以及向着光源的表面有关。,边缘与中心部分的折射光不能通过会聚相交于一点,.,109,球差,.,110,消除方法：双凸透镜，以较凸的一面向着平行光线。平凸透镜，将凸的一面向着光源。将会聚透镜和发散透镜结合起来使用，如小型天文望远镜。采用菲涅耳螺纹透镜，如：电影和舞台照明