反转录的原理及应用(1)ppt课件

,RNA反转录原理及应用,2016年11月,吴思思,1,原理,酶,过程,意义,本实验所用的技术,页码,RNA反转录,注意事项,2,RNA反转录原理,反转录是以RNA为模板,通过反转录酶(Reversetranscripatase),合成DNA的过程，是DNA生物合成的一种特殊方式。,问题1：反转录酶是指代哪些？是特定的一个还是多个酶共同作用？答：反转录酶有两种，一种是来源于哺乳动物，另一种来源于鸟类。哺乳类的反转录酶都是一条多肽链；鸟类的反转录酶则由两上亚基结构。所以反转录酶是特定的一个酶，但是它具有多种活性，在反转录不同阶段中发挥不同的作用。,3,RNA反转录原理,注：反转录与逆转录不等同。反转录是进行基因工程过程中，人为地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之为模板人工合成DNA的过程；逆转录是RNA类病毒自主行为，在整合到宿主细胞内以RNA为模板形成DNA的过程。二者虽同为RNADNA的过程，但地点不同，相对性的来说，反转录在体外，逆转录在体内。,4,RNA反转录过程,5,反转录酶（RDDP)的活性,反转录酶,以RNA为模板，催化dNTP聚合成cDNA,反转录酶,RNaseH从RNA5端水解掉RNA分子,RNaseH活性,以反转录合成的第一条cDNA单链为模板，再合成第二条cDNA分子,DNA指导的DNA聚合酶活性,问题2：反转录酶能不能现在进行生物体外技术合成？答：反转录酶是生物中提取的。还不能自主合成。,6,反转录的生物学意义,（1）对分子生物学的中心法则进行了修正和补充（2）在致癌病毒的研究中发现了癌基因，在人类一些癌细胞如膀胱癌、小细胞肺癌等细胞中，也分离出与病毒癌基因相同的碱基序列，称为细胞癌基因或原癌基因。癌基因的发现为肿瘤发病机理的研究提供了很有前途的线索。（3）在实际工作中有助于基因工程的实施。由于目的基因的转录产物易于制备，可将mRNA反向转录形成cDNA用以获得目的基因。,7,技术应用RT-PCR,RT-PCR又称反转录PCR。是将RNA的逆转录（RT）和聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的RNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物在逆转录酶的作用下反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得大量的cDNA。,问题3：cDNA与DNA的区别答：cDNA就是由成熟mRNA经过反转录过程而成反转录的DNA,与正常DNA相比区别是内部无内含子等结构。,8,技术应用RT-PCR,问题4：为什么选dT引物？答：真核生物的mRNA都有个PolyA的尾端，dT引物能识别这个尾端并且结合上去。,9,技术应用RT-PCR,引物随机六聚体引物：对总RNA进行反转录Oligo(dT)：对mRNA进行反转录,10,操作RT-PCR,以本实验下丘脑c-fosmRNA表达测定为列。,在微量EP管中加入以下反应溶液：,步骤1,dT引物dNTP混合物处理过RNA酶的水,11,操作RT-PCR,以本实验下丘脑c-fosmRNA表达测定为列。,反应结束后在冰上急速冷却，并加入以下试剂：,步骤2,得到cDNA,引物RNA酶抑制剂反转录酶处理过RNA酶的水,12,技术应用RT-PCR,PCR仪,1、按PCR仪正面左下角电源开关，启动PCR仪。2、放PCR离心管。3、反向重复第二步骤将顶盖板向后拉，盖好顶盖。4、按F2“Create”新建一个扩增的PCR程序。5、按控制台面右方上下左右方向键，可随意移动编辑位置，输入需要的温度、时间、循环数等。6、据PCR离心管中加入的反应体积总量，在“Reactionvolume”后输入相应数值，有Std“1100ul”和9600“150ul”两档可供选择。7、按F1“Start”启动8、按“INFO”对应键查看PCR结束键。9、扩增完成后按台面左方“Stop”键退出。10、按“Hist”，可查看上次扩增的历史记录。11、完全退出后，按台面左下方电源开关，拔出插销，切断电源。,13,技术应用RT-PCR,1在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。2防止DNA的污染，采用DNA酶处理RNA样品。3.防止蛋白质的污染,注意事项,14,技术应用扩展QPCR,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。,15,技术应用扩展QPCR,所以通过RT-RCR与Q-PCR联用的QRT-PCT可以测定基因的表达量。首先通过RT-PCR从mRNA得到cDNA。然后通过特