HS—SPME—GC／MS方法在白兰地香气成分分析中的应用研究

HSSPMEGCMS方法在白兰地香气成分分析中的应用研游义琳，王秀芹，战吉成，黄卫东中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083摘要利用顶空固相微草取HSSPME和气质联用技术GCMS对白兰地酒中的香气成分进行分析，研究了萃取头种类、样品酒精度、预热时问、革取温度、苹取时间和电解质NAC1用量等对白兰地酒中香气物质革取的影响，优化了提取条件；比较了不同极性色谱柱对白兰地香气成分的分析效果，建立了快速测定白兰地酒中香气物质的方法。最终确定HSSPME革取白兰地香气物质的最佳条件为采用弱极性的50MDVBCARPDMS萃取头，稀释样品的酒精度为120MLL，预热时间为20MIN，苹取温度为45。C，革取时间为30MIN，电解质NAC1浓度为030GML。并利用此方法分析了法国卡慕公司的VSOP级白兰地的香气成分，质谱图中共分离出78个峰，鉴定出49种香气物质。关键词白兰地；香气物质；极性色谱柱；固相微萃取；气相色谱质谱联用中图分类号065763文献标识码ARESEARCHONTHEANALYSISOFAROMACOMPONENTSINBRANDYBYHSSPMEGCMSYOUYILIN，WANGXIUQIN，ZHANJICHENG，HUANGWEIDONGCOLLEGEOFFOODSCIENCENUTRITIONALENGINEERING，CHINAAGRICULTUREUNIVERSITY,BEIJING100083ABSTRACTARAPIDANDSIMPLEMETHODWASDEVELOPEDFORDETERMINATIONOFAROMACOMPONENTSINBRANDYBYHEADSPACESOLIDPHASEMICROEXTRACTIONHSSPMECOUPLEDTOCAPILLARYGASCHROMATOGRAPHYMASSSPECTROMETRYGCMSDIFFERENTFIBERS，ALCOHOLDEGREE，PREHEATINGTIME，EXTRACTIONTEMPERATURE，EXTRACTIONTIMEANDCONCENTRATIONOFSODIUMCHLORIDEONTHEENRICHMENTOFVOLATILESWEREOPTIMIZEDANDTHEEFFECTOFDI腑RENTPOLARCAPILLARYCOLUMNWASALSOSTUDIEDTHERESULTSSHOWEDTHATTHEOPTIMALCONDITIONSOFSPMEGCWEREHPINN0、AX300MX025MM025MOFTHEGCCAPILLARYCOLUMN，50“MDVBCARPDMSOFTHEFIBER,120MLLOFTHEDILUTEDETHANOLCONCENTRATION20MINOFTHEPREHEATINGTIME450FTHEEXTRACTIONTEMPERATURE30MINOFTHEEXTRACTIONTIMEAND0_30GMLOFTHECONCENTRATIONOFSODIUMCHLORIDEINADDITION，78KINDSOFCOMPOUNDSINCAMUSVSOPCOGNACWERESEPARATEDAND49OFTHEMWEREIDENTIFIEDBYHSSPMEGCMSMETHODKEYWORDSBRANDY；AROMACOMPONENT；DIFFERENTPOLARCAPILLARYCOLUMN；HSSPMEGCMS香气是评判白兰地酒品质的一个重要的感观指标。白兰地酒芳香物质的种类、含量、感觉阈值及其之间的相互作用决定着白兰地酒的感官质量，它们是构成白兰地酒质量的主要因素，决定着白兰地酒的风味和典型性。感官品尝分析只能判断香气的特征口感，要确定白兰地香气收稿日期20080829广东省教育部产学研合作平台项目资助。作者简介游义琳，硕士研究生，EMAILYILIN033163COM通讯作者战吉成1972一，男，博士，硕士生导师，主要研究方向葡萄酒与白兰地检测。EMAILJCZHAN263NET8200806特征的基础成分，必须借助仪器分析。近年来，随着现代仪器技术的发展，一些精密的分析手段被应用于风味物质的分离和鉴定，如气相色谱GC、气相色谱一质谱联用系统GCMS等L。无论使用多么先进的分析手段，香气物质较完全地被抽提出来是获得理想分析结果的前提。因此，选用适当的样品前处理方法显得至关重要。目前，国内外芳香物质的提取方法主要包括液一液萃取法、吹扫捕集法、静态顶空提取法、动态顶空提取法、同时蒸馏萃取法、超临界流体萃取法和顶空固相微萃取法等几种。这些方法各有利弊，都存在一些缺陷，如液液萃取的有机溶剂有毒性，污染环境，需要样品量大且会引起某些化学结构或组分的变化；静态顶空法主要缺点是样品的蒸汽体积过大，影响色谱柱的分离效能；白兰地酒中含有乙醇，限制蒸馏萃取的应用等。顶空固相微萃取是一种全新概念的样品预处理浓缩技术，它克服了传统提取方法的缺陷，与其它技术相比，具有简便、灵敏度高、重显性及线性好、样品处理时间短，分析样品用量少，无需有机溶剂和绿色环保等优点。本文采用HSSPME萃取白兰地酒中的香气成分，结合GCMS，针对萃取头种类、样品酒精度、预热时间、萃取温度、时间和电解质用量等因素进行优化，以期为研究白兰地酒的感官风味评价提供科学依据。1材料与方法11试验材料2004年张裕白兰地酒度60，VV和卡慕VSOP级白兰地酒度40，VV为试材，并储存在4的冷藏柜内待用。主要试剂NACL分析纯；其他试剂均为国产色谱纯或分析纯。主要仪器顶空固相微萃取HSSPME装置美国SUPELCO公司；萃取头50301TIDVBCARPDMS美国SUPELCO公司；气相色谱质谱联用仪GC6890MS5973型，美国AGILENT公司。12试验方法121色谱柱的选择以2004年张裕白兰地为样品，每次加2ML样品，8ML水，2GNAC1，45OC下预热20MIN，萃取30MIN，磁力搅拌速度为1000RPM，然后进行气谱分析。选用50UMDVBCARPDMS萃取头，比较固定相分别为弱极性DB5、极性HPINN0WAX和强极性HPFFAP3种不同极性的毛细管色谱柱对白兰地酒的挥发性组分的分离效果。1_22SPME萃取条件的优化白兰地酒香气成分的萃取在15ML装有磁力搅拌器的顶空瓶中按照试验要求加入不同量的白兰地，同时加入不同量的二次重蒸水总体积为10ML，分别在不同的萃取头种类、样品酒精度、预热时间、萃取温度、时间和电解质NAC1用量情况下吸附，GC解吸7MIN，用于GC分析。1萃取头的选择以2004年张裕白兰地为样品，每次加入2ML样品，8ML水，2GNAC1，45下预热20RAIN，萃取30MIN，磁力搅拌速度为1000RPM，然后进行气谱分析，比较固定相分另为85MPA、7MPDMS、100MPDMS、50MDVBCARPDMS4种萃取头对白兰地香气成分的萃取效果，3次重复，选取最适宜的萃取头。2样品稀释度的选择根据SAVCHUK等进行的相关研究表明，用HSSPME法进行样品前处理时，白兰地酒精度数需要稀释到1OOMLL左右。为此本试验进行了60MLL、120MLL、240MLL、360MLL、480MLL及600MLL未稀释的原酒样品酒精度对HSSPME萃取效果的影响的研究。3次重复，选取最适宜的样品酒精度。3预热时间的选择参照相关文献罐】手艮道，本试验对预热时间进行了优化，分别进行了10MIN、20MIN、30MINN40MIN预热条件下的HSSPME萃取试验。每个时间做3次重复，选取最适宜的预热时间。4萃取温度的选择根据相关文献【9，在其他条件一定的情况下，本试验研究了25、35、45、55和65不同萃取温度对HSSPME萃取效果的影响。3次重复，选取最适宜的萃取温度。5萃取时间的选择根据相关文献，在其他条件一定的情况下，本试验研究了5MIN、10MIN、20MIN、30MIN和40MIN萃取时间对HSSPME萃取效果的影响。3次重复，选取最适宜的萃取时间。6电解质加入量的选择根据相关文献，在其他条件一定的情况下，本试验研究了000GML、010GML、020GML1030GML不同电解质NAC1浓度对HSSPME萃取效果的影响。3次重复，选取最适宜的NAC1用量。1_2_3色谱条件1气谱条件手动无分流进样；色谱柱为极性HPINNOWAX300MX025MM0251TI毛细管色谱柱；程序升温为40保持8MIN，以5MIN的速度升至70C保持LMIN，后以5MIN的速度升至185，再继续以10MIN的速度升至230保持8MIN。检测器温度250C；进样口温度280OC。2质谱条件EI电离源，电子能量为70EV，扫描范围50500AMU，离子源温度250OC。分析结果运用NIST2005标准谱库进行检索。3定性、定量方法质谱结果经计算机检索NIST2005，并结合已有的文献报道进行定性分析。利用面积归一法计算已定性出的香气物质的相对含量。2结果与分析21色谱柱的选择根据相似相溶原理，分离非10200806极性混合物一般选用非极性固定液的毛细管柱，分离中等极性混合物则选用中等极性固定液】，分离极性组分选用极性固定液，而白兰地中的香气物质非常复杂，种类较多，极性也不相同。因此，有必要比较不同极性的色谱柱对白兰地香气物质分离的效果，进而选择出最佳极性的色谱柱。通过试验得出，弱极性DB一5柱、极性HPINNOWAX柱和强极性HPFFAP柱均能对白兰地酒的挥发性组分进行分离，但分离效果显然不同。DB5能检测到的组分数为59种，HPINNOWAX能分离出的组分数为73种，而HPFFAP只能检测到36种。说明弱极性DB一5柱和强极性HPFFAP柱对各组分的分离效果不RIHPINNOWAX极性柱，所分离的组分响应值较低，不利于后续定性定量分析。因此选择极性HPINNOWAX毛细管色谱柱用于后续研究。22SPME萃取条件优化从热力学和动力学分析可知，固相微萃取吸附效率的影响因素主要包括萃取头的极性大小、样品稀释度、预热时间、萃取温度、萃取时间和电解质加入量。以下分别对这6个影响因子作单因素试验。221萃取头固定相极性对SPME萃取效果的影响通过试验得出，85“MPA、7MPDMS、100MPDMS、50“MDVBCARPDMS4种萃取头萃取到的除乙醇外的挥发性物质的峰面积总和分别为8659627、245361、7840223和8789915，峰个数分别为38、5、3648个。由此可以得出，固定相为50MDVBCAPDMS的萃取头萃取到的芳香物质的种类和含量最高，即萃取效果最好。2_2_2样品稀释度对HSSPME萃取效果的影响根据SAVCHUK等进行的相关研究表明，用HSSPME法进行样品前处理时，白兰地酒精度数需要稀释到100MLL左右。通过本试验得出，从6种不同酒精浓度的白兰地中萃取到的除乙醇外的挥发性物质的峰面积总和分别为6855283、8789915、4957657、1158300、993521,N954942，峰个数分别为43、48、35、16、L4和15个。由此可以得出，酒精度从60MLLIJ120MLL之间，随着酒精度的增加即样品浓度的增加，除乙醇之外的香气成分的峰数即香气物质种类、面积及其所占面积百分比有所增加，但之后开始下降。这是由于当样品浓度过低时，萃取头吸附未达到饱和，所以当样品浓度适宜增加时，萃取的挥发物质的量就会相应增加；然而当样品超过一定酒精度时，峰数随着酒精度的增加反而减少，这是由于萃取头吸附层的表面积是一定的，当样品中某一物质的浓度越高时，那么该萃取头吸附的物质组成中这种物质就越多，那么吸附其他挥发成分就会相应减少。结合已有研究和本试验的结果，后续研究中白兰地酒精度数稀释到120MLL。223预热时间对HSSPME萃取效果的影响通过试验得出，4个预热时间萃取到的除乙醇外的挥发性物质的峰面积总和分别为5702586、8789915、8721178；18769304，峰个数分别为21、46、48和46个。可见，随着预热时间适当延长，萃取的香气成分的种类和数量有所增加；而当时间达到一定长度时即分析物在溶液和顶空两相中达到平衡时，萃取的香气成分的种类和数量几乎不变。结合已有研究I】和本试验结果，且从节约时间的角度考虑，选择预热时间为20MIN。224萃取温度对HSSPME萃取效果的影响通过试验得出，5个萃取温度萃取到的除乙醇外的挥发性物质的峰面积总和分别为6777088、7441489、8789915、8865605N5540729，峰个数分别为35、42、48、47；136个。可知，随着温度的升高，大部分香气的萃取效率变高，当达到一定温度后，又呈下降趋势。在2545之间时，萃取的香气物质种类和含量随着萃取温度的升高而增加；而在5565之间时，萃取的香气物质种类和含量随着萃取温度的升高而减少；萃取的香气物质种类和含量在45和55萃取条件下差异不大，但是考虑到单个香气物质和气谱图的峰形，且高温下还有可能使白兰地香气成分发生改变，从而影响其原有风味，所以选择45为最佳萃取温度。22。5萃取时间对HSSPME萃取效果的影响通过试验得出，5个萃取时间萃取到的除乙醇外的挥发性物质的峰面积总和分别为4531466、5902586、8239922、8789915和8685608，峰个数分别为16、26、46、4846个。随着萃取时间延长时，吸附的香气成分的种类及含量相应增加；而萃取时间过长时，又由于一些香气物质含量的减少而使总体的香气成分略少于30MIN时的值；总体香气成分的种类和含量在萃取30MIN达到最高值。与相关文献报道的结果一致。因此，在后续试验中选取萃取时间为30MIN。226电解质加入量对HSSPME萃取效果的影响通过试验得出，4个NACL浓度萃取到的除乙醇外的挥发性物质的峰面积总和分别为7320472、8522919、8721178、8879108，峰个数分别为38、47、48H49个。在不JLLNAC1的空白试验中，萃取的香气物质的种类和量都未达到最大值，说明电介质对其萃取效果有明显影响；随着NAC1用量的不断增加，样品中香气物质的萃取率也随之增加。大部分挥发性组分在加入NAC1电解质至饱和时的萃取量明显高于添加不饱和NAC】和不加NAC1的样品，一些半挥发性组分在加入适量NAC1时的萃取率达到最大，加入NAC1饱和时反而有所下降，这是因为增大溶液的离子强度，可以降低基体对挥发性物质的束缚，提高其中有机物质的逸出活度，促进其从液态基质中挥发出来，吸附到萃取头上。但有研究表明，离子浓度增加的同时，也阻碍了待测样品中一些半挥发性和难挥发性组分向顶空气体中逸散，从而降低了这些物质的提取效果J。总体香气组分和含量在030GML的浓度下，效果比较好。所以在确定加盐量参数试验中选030GML60饱和的添加量为最佳加盐浓度。23白兰地香气成分的GCMS定性分析利用上述已经优化的HSSPME与GCMS联用方法对卡慕VSOP级白兰地的香气成分进行检测和分析。质谱图中共分离出78个峰，根据NIST2005谱图提供的标准质谱图对照，结合相关文献报道M，共鉴定出49种挥发性物质表1，这些成分主要属于酸、醇、酯、羰基化合物等4类物质，该结果与相关文献报道相符合。在鉴定出的物质中，酯类、醇类和酸类的种类最多，其总数分别为19、17和3种，分别占香气种类总数的388、347和612，其他物质10种，占204。质量浓度较高的成分是酯类和醇类，酯类的总数略多于醇类，该结果与相关文献13151报道相符合。卡慕VSOP级白兰地中含量排在前几位的香气成分20080611表1卡慕VSOP中鉴定的芳香物质35948811355117591285815402L59691695019165197012010720519208052214222473245852510625349257562644727443276262825828837291963019430868320893272933348338783402934584347813687036370723739520384017139408004041788414259642426804344284444708445474684649494475148748528441一PROPANOL1PROPANOL，2METHYLLBUTANO13METHYL，ACETATE1一BUTANOL1BUTANOL，3一METHYLHEXANOICACID，ETHYLESTERETHYLORTHOFORMATELPENTANO14METHYL一1一PENTANO13METHYLPROPANOICACID，3ETHOXY一，ETHYLESTERPROPANOICACID，2HYDROXY一，ETHYLESTER1HEXANOL3HEXEN一1一OL，Z一2NONANONE0CTANOICACID，ETHVLESTERACETICACIDISOPENTYLHEXANOATEFURFURAL1HEXANO12ETHY14METHYL一1，3一HEPTADIENEC，T2一HEPTANOLBENZALDEHYDE1，6OCTADIEN一3一OL，3,7一DIMETHYL一1一OCTANOL2FURANCARBOXALDEHYDE，5METHYLDECANOICACIDMETHYLESTER2FURANCARBOXYLICACID，ETHYLESTEDECANOICACIDETHYLESTEROCTANOICACID，3METHYLBUTYLESTERBENZOICACIDETHYLESTERBUTANEDIOICACID，DIETHYLESTEREMVL9一DECENOATEDMENTHLEN一8OLNAPHTHALENE，1，2DIHYDROL，1，6一TRIMETHY11DECANOL2BUTEN1ONE，1一2，6，6一TRIMETHYL一1，3一CYCLOHEXADIEN一1一Y1一，EDODECANOICACID，ETHYLESTERPENTADECANOICACID3METHYLBUTYLESTERBENZENEPROPANOICACID，ETHYLESTERPHENYLETHYLALCOHOLBUTYLATEDHYDROXYTOLUENE1TRIDECANOLTETRADECANOICACID，ETHYLESTEROCTANOICACIDCEDROLNAPHTHALENE，2,3，6TRIMETHYLNAPHTHALENE，1，6DIMETHYL一4一1METHYLETHY1一NDECANOICACID丙醇2一甲基丙醇乙酸异戊酯丁醇3一甲基丁醇己酸乙酯甲酸三乙酯4一甲基戊醇3甲基戌醇3一乙氧基丙酸乙酯2羟基丙酸乙酯己醇叶醇2一壬酮辛酸乙酯乙酸己酸异戊酯糠醛2乙基己醇4一甲基一1，3庚二烯2一庚醇苯甲醛3，7一二甲基一1，6辛二烯一3醇辛醇5一甲基糠醛癸酸甲酯呋喃甲酸乙酯癸酸乙酯辛酸3一甲基丁酯安息香酸乙酯琥珀酸乙酯9一癸烯酸乙酯D一松油醇1，2一二氢一1，1，6一三甲基奈癸醇B一大马酮月桂酸乙酯十五烷酸3一甲基丁酯苯丙酸乙酯苯乙醇丁羟基甲苯十三醇肉豆蔻酸乙酯辛酸雪松醇2，3，6三甲基萘1，6二甲基一4一1一甲乙基一萘C3H80C4HLOOC7HI4O2C4H1OOC4HL00C8H16O2C7H16O3C6HL4OC6H14OC7HL403C5H1OO3C6HL4OC6H120C9H18OCL0H2OO2C4H4O2CL1H22O2C5H4O2C8HL80C8H16C7H160C7H6OC1OH2O0C8HL8OC6H6O2C】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，4679MN“加如依次是3一甲基丁醇、辛酸乙酯、2一甲基丙醇、癸酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯、己醇、月桂酸乙酯、糠醛。这几种成分在该款白兰地中所占比例为9475，构成了卡慕VSOP的主要香气成分。其中含量最高的是3甲基丁醇，占香气总量的4276。3小结31通过试验得出，HSSPME萃取白兰地香气物质的最佳条件采用弱极性的50MDVBCARPDMS萃取头，稀释样品的酒精度为120MLL，预热时间为20MIN，萃取温度为45，萃取时间为30MIN，电解质NACIJII浓度为030GML。32利用HSSPMEGCMS方法在卡慕VSOP干邑中定性了49种芳香组分，主要是醇类、酯类和羧酸类化合物。33需要进一步试验进行准确的定量，分析它们是如何以不同比例的混合，进而构成不同葡萄品种、不同陈酿时间、不同酿造工艺等白兰地的香气特点的。参考文献1王恭堂白兰地工艺学第一版M北京中国轻工业出版社，2002，121892李记明，贺普超，刘玲优良品种葡萄酒的香气成分研究J】西北农业大学学报，199812693】王立，汪正范色谱分析样品处理第二版M】北京化学工业出版社，2006，431804吴烈均气相色谱检测方法第二JTKM北京化学工业出版社，2005，52695盛龙生，苏焕华，郭丹滨色谱质谱技术第二版M北京化学工业出版社，2006，11266SASAVCHUK，GMKOLESOVCHROMATOGRAPHICTECHNIQUESINTHEQUALITYCONTROLOFCOGNACSANDCOGNACSPIRITSJJOURNALOFANALYTICALCHEMISTRY，2005，87527717JANCRDEMYTTENAERE，ETA1ANALYSISOFVOLATILESOFMALTWHISKYBYSOLIDPHASEMICROEXTRACTIONANDSTIRBARSORPTIVEEXTRACTION