生物活性胶原蛋白及明胶形态的表征研究

离子交换与吸附，2010，261535810NEXCHANGEANDADS0R10N文章编号10015493201001005306生物活性胶原蛋白及明胶形态的表征研究齐晓玲李贺先王国昌料胡月晗左仁贵功能高分子材料教育部重点实验室，南开大学高分子化学研究所，天津300071摘要采用弱酸处理法，从新鲜牛皮中提取了胶原蛋白，通过与明胶对比，采用CD、AFM、FRIR和荧光方法对其结构形态进行了表征研究。结果表明，所提取胶原蛋白保持了固有的生物活性，具有典型的旺螺旋结构。首次建立了稳态荧光的表征方法，不仅与其他方法具有重要互补性，而且具有准确、灵敏、快捷的特点，是表征、研究胶原蛋白及其变性，复性行为的有效手段。关键词胶原蛋白；明胶；结构形态；稳态荧光中图分类号06297文献标识码A1前言胶原蛋白是一种由动物细胞合成的生物高分子，对于机体具有十分重要的意义【1】。明胶是胶原蛋白的典型变性形态。胶原蛋白和明胶已被广泛地用作生物高分子材料和医用材料，它被称为是“一个值得永远研究且具有多用途的生物高分子材料”L5J。胶原蛋白结构、生物活性等性能的表征，特别是对反映胶原蛋白微观结构形态的表征已成为研究重点。为此，建立准确、灵敏、快捷的表征方法对胶原蛋白及明胶的基础和应用研究具有重要意义。胶原蛋白具有生物活性的重要标志是其多肽链中0【。螺旋结构含量在50以上，其在溶液中的主要表征手段有红外光谱和圆二色光谱。红外光谱信噪比较差J。圆二色光谱是表征其化学结构信息，特别是对指纹特征信号弱样品表征的一种较成熟方法，但测量过程耗时较长，参考蛋白质数量和种类的不同，以及计算拟合方法的不同，所得结果常有偏差【7J。本文首次提出利用胶原蛋白中03酪氨酸残基荧光性质，研究胶原蛋白和明胶多肽高分子链聚集形态，并与其他常规表征方法相比较，给出胶原蛋白变性前后其荧光特征光谱。收稿日期2009年2月L0日项目基金国家自然科学基金20774053，20974056；天津市自然科学基金03380261作者简介齐晓玲1981，女，黑龙江省人，硕士研究生通信联络人EMAILGCWANGNANKAIEDUCN54IONEXCHANGEANDADSORPTION2010年2月2实验部分21试剂及测试仪器试剂氯化钾AR，磷酸氢二钠AR，磷酸氢二钾AR，柠檬酸钠AR，氯化钠AR；明胶是牛皮胶原蛋白I型水解产物ALDRICH。试验仪器UV762紫外可见吸收光谱仪；PHILIPSTECNAIG2F20TEM透射电镜；BIORADFTS135傅立叶红外光谱仪；SPEXFL212荧光谱仪；J810圆二色光谱仪；NANOSCOPERIILA，DIGITALINSTRUMENT原子力显微镜。22胶原蛋白提取步骤根据文献8，取新鲜腹部牛皮，经去肉、脱毛后，研磨至最细小的状态约200G，先后用10NAC1溶液洗涤牛皮8次，0067MOLL的NA2HPO4溶液洗涤牛皮5次，015MOLL、PH为37的柠檬酸钠溶液洗涤4次，保留上清液。之后，在上清液中加固体KC1至06MOLL，加NA2HPO4至PH为58。离心后固体为胶原蛋白粗品。最后将固体用02MOLL醋酸溶液溶解、离心，除去固体残余物，用LNAC1溶液透析上清液、离心，得到胶原蛋白固体，低温保存。2_3样品的制备与表征231样品制备室温下25将0001G明胶溶于LOOML去离子水，即可制得浓度为1OXLOGML的明胶溶液；取一定量配好明胶溶液在60下退火20D，可得到退火明胶溶液。童232胶原蛋白溶液浓度表征选用浓度为05MGML的牛血清蛋白BSA0做标准溶液，配置系列浓度的溶液，制作出标准曲线见图1，相关系数09971。取胶原蛋白少量于去离子水中，充分溶解2D，超声、离心，取上清液。然后根据考马斯亮蓝G250方法测得其饱和溶液浓度9】。通过计算，测得胶原蛋白饱和溶液的浓度为43XLOGML，并用稀释法制备浓度为1OXLOGML胶原蛋白溶液。PROTEINCONTENT；图1胶原蛋白的紫外标定曲线将配置好的3种溶液在低温下8“C保存，以保持其构象稳定。第26卷第1期离子交换与吸附23_3红外衰减全反射表征将2_31中制得的3种溶液与KBR固体混合，常温下静置，待水挥发干后刮下粉末再进行红外衰减全反射测试。234圆二色谱表征将231LJ的3种溶液在室温下251进行测试，将测试结果进行杨氏模拟计算。2_35荧光光谱表征将23】中的3种溶液在室温下F251进行荧光测试，测试中选取激发波长280NM。3结果与讨论31胶原蛋白形态表征胶原蛋白变性与否的重要标志是胶纤维形态与结构的存在。文献报道5个胶蛋白分予链几J聚集形成一个胶原微纤维，这些胶原微纤维的横截宽度为35NMML1。本文采用了浓度为110ML胶蛋白水溶液，用了力显微镜和透射电镜表征，得到清晰的胶原蛋白纤维图像见罔2。由2AAFM胶原蛋白图像可见，其纤维链长度分布在2GIN以上；我们统计了大约10O根以_卜纤维链，发现其平均表观宽度约为2040NM，平均高度约在053NM之问。由于图2AFM和TEM图像A胶蛋NFAFM；B峻麒蛋NFTEMC明胶AFSD退火明胶AFMAFM选择的TAPPING模式，以及分予链和云母之问的作用力强于链问范德华力，所测得胶原蛋白分子的高度小于其实际高度，宽度大于真实尺度。VESENKA等U2发现生物大分子的表观宽度与扫捕针尖的曲率半径尺和被测分子的有效半径尺关系为W4尺。根据该公式计算得到，展宽影响约为6M2倍。经计算修正发现，我们测得的胶原蛋白纤维实际宽度为3NM左有，大约由34胶原蛋白分子链构成，与文献报道值丛本相同。胶蛋白的透射电镜照”罔2B也显示胶原蛋白清晰长纤维形态，链宽为4NM芹右。冈2C、罔2D为胶的AFM陶像，我们可以看J明胶呈现高度为05NM左有，宽度为60NM左有的不规则聚集链状物；而退火后的咧胶，则表现为些大小不R的分立聚集体。该现象牛要源于明胶分了在退火前3J，有部分纤维形态存在，此现象将在其结构的表实验中进步得到证实。比较胶蛋白和明胶的显微【像，清楚地说明，我们制备的胶原蛋白具有特胶原纤维形态。56IONEXCHANGEANDADSORPTION2010年2月32胶原蛋白和明胶结构表征RICHARDMENDELSOHN和CAROLRFLACHT13,14报道了蛋白质溶液的红外特征谱，其CC螺旋特征谱带在1655CM附近，折叠谱带为16201630CM或者16801690CM，无规线团谱带为16401650CM。由于蛋白质溶液信噪比较差，本文采用溶液与KBR混合压片法，得到清晰的光谱图见图3。胶原蛋白样品在1653CM处有非常明显的螺旋峰，而没有折叠信号峰；明胶样品1624CM处存在明显的折叠信号；退火后明胶溶液1647CM可见无规线团谱带，此结果可进一步采用圆二色谱表征。A胶原蛋白；B明胶C退火明胶图3红外光谱图由表1圆二色谱的杨氏模拟结果可见，胶原蛋白中一螺旋的含量为745，没有折叠结构，与报道结果相；明胶中含有663的。折叠，不存在一螺旋结构；退火后明胶溶液仅含有无规线团结构。3种样品表征结果与红外结果一致，表明3种样品分别具有典型的胶原蛋白及其变性形态结构。表1圆二色模拟结果MO133胶原蛋白及明胶的荧光光谱本文以胶原蛋白多肽链中酪氨酸残基作为固有荧光标记。图4是激发波长为280NM的胶原蛋白、明胶、退火明胶溶液的稳态荧光发射光谱。图中胶原蛋白分别在340RIM和420NM出现两个荧光谱带，谱带较窄，对称性较好，表明在胶原蛋白中具有两种酪氨酸残基相互作用结构。我们所制备胶原蛋白溶液，经AFM证实其微观上是由34个胶原蛋白分子链构成。分子内和分子间螺旋链以氢键、疏水键和共价键等作用保持其结构的稳定性，其中WAVELENGTHA胶原蛋白；B明胶C退火明胶图4稳态荧光光谱图280NMOU_【量昌善第26卷第1期离子交换与吸附酪氨酸残基的兀一兀相互作用是疏水作用的重要组成。由表1可知，胶原蛋白中存在3种结构，由于一转角仅由四个氨基酸构成，存在芳香聚集的可能性极小，故荧光光谱所表征的两种结构主要是一螺旋以及无规线团结构中酪氨酸残基形成的氢键和基态二聚体。分布较窄且对称的荧光谱带恰恰反映了在胶原蛋白特征有序结构中，芳香环相互作用的稳定能态图4A。明胶是胶原蛋白的变性产物，它丧失了原有胶原蛋白的A螺旋结构，转变为大量的折叠构象。片层结构特点是肽链充分伸展，肽链平面之间折叠成锯齿状。氨基酸残基的R侧链伸出在锯齿平面之外。与GC螺旋结构不同的是其结构稳定性仅依靠两条肽链或一条肽链内的两段肽链间的CO与氨基中H形成氢键，而与疏水作用无关。P片层结构正、反平行能相互交替，并可形成多层结构。因此，片层结构中酪氨酸的酚侧基主要处于非结合态，而少数处于多层结构或无规线团中的酪氨酸可形成氢键或二聚体。如图4B所示，明胶溶液的荧光光谱呈现335NM主峰和415NM弱发射带，并且总体荧光强度与胶原蛋白相比，大幅度降低。其中335NM发射峰可归属于非结合和少数形成氢键酪氨酸残基的混合发射；而415NM弱带则为多层一结构和无规线团中形成的少数二聚体。总体荧光强度降低则进步表明多数酪氨酸残基处于非结合态，本征荧光淬灭作用增强。这与表1中圆二色谱测试结果完全一致。退火后的明胶已经丧失其空间有序结构，在溶液中仅以无规线团形式存在F见图2，表1，肽链的运动增强，构象增加，使得酪氨酸7【兀相互作用几率增大。如图4C所示，退火明胶的荧光光谱在350415NM区间呈现较宽和相对较强的发射谱带，表明形成了多种不同能态的聚集体。这一结果与蛋白质变性后紫外吸收强度增加的文献报道相一致。4结论通过CD、AFM、FTIR和荧光光谱的研究，证明我们提取的胶原蛋白具有生物活性结构，而明胶和退火明胶是两种典型胶原蛋白变性产物。本文利用胶原蛋白中百分摩尔含量仅为O3的酪氨酸残基的荧光性质，首次得到3种具有典型结构的胶原蛋白样品即活性胶原蛋白、明胶以及退火明胶的特征荧光谱带。建立了生物活性胶原蛋白的稳态荧光表征方法，与其他方法相比，具有准确，灵敏，快捷，测试简单以及原位表征的特点，避免了制样方式造成样品的形态改变。此方法不仅是对胶原蛋白表征方法的重要补充，而且也是研究胶原蛋白变性复性行为的有效手段。参考文献1】KUZNETSOVAN，RAUDC，PARSEGIANVA，LEIKINS，BIOPHYSJ】，1997，721353362【2】VITAGLIANOL。，BERISIOR，MASTRANGELOA，MAZZARELLAL，ZAGARIA，PROTEINSCIJ，2001，10122627263258IONEXCHANGEANDADSORPTION2010年2月【3】BANNJG，BACHINGERHR，BIOLCHEMJ】，2000，2752446624469【4】ORGELJE，MILLERA，IRVINGTC，ETA1，STRUCTUREJ，2001，91110611069【5】FREEDCE，VUNJAKNOVAKOVICQIRONKJ，BIOTECHNOLOGYNYJ，1994，1276896936】WUYUQING，OZAKIYUKIHIRO，INFRAREDMILLIMWAVES【J】，2003，2231611687】沈星灿，梁宏，分析化学评述与进展J，2004，3233883948】RUBINAL，DRAKEME，DAVISONEE，PAFAHLD，BIOCHEMISTRYJ，1965，42181190【99FREDERICKMAUSUBEL，精编分子生物学实验指南【M】，北京科学出版社，1999，P33233310】OTTANIV，MARTINID，FRANCHIM，ETA1，MICRONJ，2002，3378587596【11】HULMESDJ，STRUCTBIO1J，2002，1371210【12】VESENKAJ，GUTHOLDM，TANGCL，ETA1，ULTRAMICROSCOPYJ，1992，424412431249【13】RICHARDMENDELSOHN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