抗菌肽产品研发背景PPT课件

1,1,谯仕彦,2012.12.08潍坊,欢迎各位嘉宾莅临指导！,抗菌肽产品研发背景与过程,北京中农颖泰生物技术有限公司技术部,3,颖泰集团研发平台介绍,一,目录,4,颖泰集团研发平台介绍,一,目录,5,颖泰集团,颖泰集团,林州市华帅化工有限公司,河南颖泰化工有限责任公司,山东莘县颖泰化工有限公司,中农颖泰林州生物科园有限公司,北京中农颖泰生物技术有限公司,北京龙科方舟生物工程有限公司,6,获证科研组织,颖泰集团研发平台介绍,7,颖泰集团研发平台介绍,研发单位-国家饲料工程技术研究中心,国家饲料工程技术研究中心（“工程中心”）是2000年6月经国家科技部批准成立，以中国农业大学和中国农科院饲料研究所为依托，是我国饲料行业唯一的国家级工程技术研究中心。专业从事饲料及饲料添加剂工程化技术开发、技术集成与二次开发、成果转化与技术转移以及专业技术服务的高新技术企业。,8,颖泰集团研发平台介绍,研发平台-饲用抗菌肽北京市工程实验室,饲用抗菌肽北京市工程实验室是2011年10月由北京市发展和改革委员会颁发成立，是国内唯一一家与业从事饲用抗菌肽的研发机构，目前主要专攻于天蚕素产业化、纯化及机理等方面研究，同时开展多种类抗菌肽的机理及产业化方面的研究工作，目前已经有多种抗菌肽实现中试生产。,9,颖泰集团研发平台介绍,研发平台-生物饲料添加剂北京重点实验室,生物饲料添加剂北京重点实验室是2010年由北京市科委颁发成立，国内首家专业从事饲料科学分子生物学和基因工程实验室的机构。目前在研项目主要有：屎肠球菌、植物乳杄菌、酵母、地衣芽孢杄菌、抗菌肽、植物提取物等。,10,谯仕彦博士生导师中国农业大学动物科技学院教授农业部饲料工业中心主任中国农业大学动物科技学院动物营养系主任,颖泰集团研发平台介绍,研发团队,11,研发人员（总人数为70人）,颖泰集团研发平台介绍,12,颖泰集团研发平台介绍,13,颖泰集团研发平台介绍,颖泰集团研发实验室-昌平南口,研发基地：昌平南口承担微生态制剂的科研,14,颖泰集团研发平台介绍,颖泰集团研发实验室-中农大西校区,中国农大西校区：承担基因工程及生物医药科研,15,中国农大西校区动医/动科大楼（一楼）承担抗菌肽质量标准和蛋白质组学研究,颖泰集团研发平台介绍,颖泰集团研发实验室-中农大西校区动科大楼,16,17,生物领域国家饲料工程技术研究中心3个国家科技进步二等奖48个授权专利、22个鉴定成果、农业口3个运行优秀的国家工程技术研究中心之一生物饲料添加剂北京市重点实验室、北京市科技研究开发机构（北京市科委）饲用抗菌肽北京市工程实验室（北京发改委）2009年获得中国市场技术金桥奖全国饲料产业技术创新战略联盟理事长单位“十一五”国家科技计划优秀执行团队北京市技术交易中心的重要成员、广东省产学研联盟副理事长单位,颖泰集团研发平台介绍,18,颖泰集团研发平台介绍,河南省抗菌肽工程技术研究中心河南省科学技术厅颁发,19,颖泰集团研发平台介绍,一,目录,20,抗生素和饲用抗生素的定义,是微生物在新陈代谢过程中产生的，具有抑制他种微生物的生长和活动，甚至杀灭他种微生物的化学物质（WaRsman,1942）。饲用抗生素：在健康动物饲料中、以改善动物营养状况和促进生长为目的、具有抗菌活性的微生物代谢产物。,21,Wisconsin大学1950-1961年抗生素饲喂肉鸡的试验效果,22,饲料中使用抗生素对猪的作用效果,促进猪的生长断奶仔猪：提高16.4%生长猪：提高10.6%育肥猪：4.2%提高饲料转化效率断奶仔猪：6.9%生长猪：4.5%育肥猪：2.2%猪的发病率和死亡率：减少50%,（Cromwell，2001）,23,耐药性的产生及其机理,（1）产生药物失活酶：如金属-内酰胺酶，能灭活青霉素、头孢霉素（2）靶部位改变（3）建立靶旁路系统（4）代谢途径改变（5）细菌细胞（壁）通透性降低：膜蛋白变性、通道蛋白或外膜蛋白缺失（6）膜泵外排：5个家族、20多个外排泵，是四环素、氯霉素、喹喏酮类药物最常见的耐药原因,24,一些抗生素产生耐药性的方式,25,耐药基因的传递与多重耐药性,垂直传递：一旦出现耐药基因，细菌就会将耐药基因向后代传递。细菌的快速繁殖，使耐药速度快速增长,水平传递：耐药性通过转化、转导、结合等方式在不同细菌间传递，产生多重耐药性,26,沙门氏菌的耐药性检测分析（%）,DR:双重耐药性；MR:多重耐药性,27,全世界，每年因病菌产生的耐药性而在人和动物上增加的治疗成本估计在170-260亿美元之间，而且会诱发更严重、更持久的感染。（Roberts等，2009）2008年，我国因耐药性死亡80000多人，每个国民承担的经济损失4050元人民币。,耐药性问题造成的损失,28,防止细菌耐药性的对策,管理对策（1）明确各级医院处方范围和各级医师的处方权限（2）根据药敏试验选用药物（3）尽量选用窄谱抗菌药，联合用药不超过2-3种（4）如轮换用药，坚决反对滥用（5）严格控制抗生素在农林、养殖、饲料中的使用（6）加强致病菌的监控，掌握致病菌的变化及耐药情况禁止抗生素在饲料中的使用,29,抗生素禁用的历程,1丹麦养猪生产委员会，引自Gallois等（2009）。,30,中国兽用抗生素发展情况,2009年：我国抗生素用量21万吨，饲料用抗生素9.7万吨，占人、动物、化妆品、食品等总用量的46.1%（农业部）2007年：兽用抗生素总产值近200亿元（中国动物保健品协会）。WHO：我国高达50%以上的细菌有多重耐药性，欧洲5%展望：我国的养殖环境决定了在一定的时期内仍然会使用抗生素，但政府的限制会越来越严格。,31,目前应用于食品动物生产中的抗生素替代产品,促生长,治疗兼促生长,32,颖泰集团研发平台介绍,一,目录,33,1980年瑞典科学家Boman等用阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹产生出有抗菌活性的多肽物质，定名为天蚕素（Cecropins）。目前已经发现4000多种抗菌肽，鉴定出结构的有1000多种。,抗菌肽的发现,34,抗菌肽的概念,抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，由20-60个氨基酸组成，分子量在2000-7000左右。或者说抗菌肽是由动物机体（包括人体）产生的、并具有与机体先天性免疫紧密相关的特定功能的小分子多肽。抗菌肽的特点理化性质：强碱性、热稳定性。抗菌谱广：细菌，部分真菌、原虫、病毒及癌细胞。,35,抗菌肽的分类-按来源分类,36,抗菌肽的生物活性作用,37,抗菌肽作用与对病原菌细胞膜的破坏有关：抗菌肽接触到病原菌后，首先带正电荷的抗菌肽与病原菌细胞膜上带有负电荷的磷脂结合，然后取代磷脂分子的位置，使细胞膜发生相变，形成离子通道。离子通道形成后可以导致病原菌细胞死亡。,抗菌肽的抗菌机理-物理性消融,38,抗菌肽的抗菌机理-高度选择性,39,鲎素,40,(谢海伟等，2008),鲎素,41,鲎素,42,猪小肠抗菌肽,(马卫明等，2005),43,43,抗菌肽是动物体免疫组成的实例,始作俑者：甲类链球菌,受害者：人类皮肤,44,小鼠模型验证抗菌肽cathelicidin抑制甲型链球菌作用,小鼠模型成立的条件：a：小鼠有与人类相似的cathelicidin抗菌肽家族（CRAMP和LL-37），且由类似的基因编码（Cnlp和CAMP）；b：两种抗菌肽有相似的-螺旋结构、抗菌谱和组织分布状况。,验证方案：1：敲除小鼠Cnlp，使其无法合成cathelicidin抗菌肽，感染甲型链球菌并观察皮肤溃烂状况，与正常小鼠对照；2：从对照和敲除基因的感染小鼠取样做组织培养，并在敲除基因小鼠的培养物中添加抗菌肽CRAMP，观察病菌数量；,（Nizet等，2001）,45,正常对照组小鼠组织培养物内病菌极少,敲除基因但添加抗菌肽小鼠组织培养物内病菌数量较少，病菌受到抗菌肽抑制,敲除基因未添加抗菌肽小鼠组织培养物内病菌数量最多,46,抗菌肽与抗生素作用的比较,来源：抗生素来源于微生物，抗菌肽是动植物和微生物防御系统的组成部分。作用范围：抗生素仅能杀死与抑制细菌，抗菌肽不仅对细菌有抑制和杀灭作用，还对真菌、病毒和肿瘤细胞有抑制作用。对细菌的作用机理：抗生素作用的基础是与细菌细胞膜的受体结合，抗菌肽通过物理消融作用于细胞膜，这是抗菌肽不易产生耐药性的重要原因。与机体免疫的关系：抗菌肽诱导非特异性免疫反应，范围广泛，是其不易产生耐药性的另一个原因。抗菌肽比抗生素作用效果快。,47,47,抗菌肽的应用,食品防腐保鲜-乳链菌肽（nisin）医药-消炎、抗感染、抗真菌保健品-国内已有抗菌肽概念的“食字号”保健品上市，其中大部分为技术含量较低的昆虫蛋白日化-日用化工产品主要集中在化妆品上，以创伤疤痕修复为主，兼具温和杀菌、抗感染和消除红肿等功效,48,49,49,50,51,抗菌肽研发的问题与前景,基础研究：鉴定出结构和功能的抗菌肽4000多种。国外：5个药（包括1个兽药）完成了第期临床实验，马盖宁和Mastcell有望于在2013年上市，4个药完成了第期临床实验，均为化学合成。国内：温州某集团用生物工程技术实现了乳链菌肽(Nisin)的产业化生产，己在国内外广泛销售。用生物工程技术研究开发抗菌肽是发展的趋势。,52,颖泰集团研发平台介绍,一,目录,53,成功地在枯草芽孢杆菌中表达出安全、高效的天蚕素抗菌肽，解决了国外以大肠杆菌为表达载体的安全风险获得了天蚕素抗菌肽的氨基酸序列和空间结构完成了天蚕素抗菌肽的抗菌谱完成了菌种遗传稳定性试验、毒理学评价和产品稳定性试验开展了80多个动物饲喂试验2009年完成5吨罐中试生产试验,完成的工作,54,1、载体构建、表达与氨基酸序列,载体的构建：,（Chen等，2009）,55,表达产物的氨基酸序列和分子量,表达产物的氨基酸序列：KWKLFKKIEKVGQRVRDAVISAGPAVATVAQATALAK分子量为3866.64Da,（Chen等，2009）,56,表达产物的二级结构,表达产物纯化后，圆二分光光度仪测定二级结构表明：两亲性-螺旋占78，无规则卷曲21，无折叠，属于线性结构。,（Chen等，2009）,57,表达产物的三级结构,应用Anthe-5.0软件分析表达产物三级结构如图所示：,（Chen等，2009）,58,2、天蚕素抗菌肽的最小抑菌浓度（抗菌谱）,（Chen等，2009）,59,3、生物学特性-热稳定性研究（时间20min）,（Chen等，2009）,60,生物学特性对pH的耐受性,（Chen等，2009）,61,生物学特性对消化酶的稳定性试验,（Chen等，2009）,62,4、天蚕素抗菌肽安全评价试验,（1）大小鼠急性毒性试验：LD50大于5000mg/kg体重（2）小鼠骨髓细胞微核试验：结果为阴性（3）小鼠精子畸形试验：试验结果为阴性。（4）大鼠精子畸形试验：结果为阴性（5）亚慢性毒性试验：无明显亚慢性毒性。（6）大鼠慢性毒性试验：饲喂大鼠1年，无慢性毒性,63,5、建立了有效含量的检测方法拿到了99.6%纯品,64,建立了初步的质量标准,65,国家级科研成果！,66,天蚕素抗菌肽,天蚕素抗菌肽优秀新产品证明,67,抗菌肽是动植物非特异性免疫系统的重要组成部分。一些营养物质，比如短链脂肪酸可以诱