动物细胞工程(优质课)PPT课件

-,1,植物组织培养,植物体细胞杂交,回顾：,植物细胞工程常用的技术手段有哪些？,植物组织培养技术的原理是什么？,细胞的全能性,-,2,-,3,专题2,细胞工程,动物细胞工程,课题2,-,4,动物细胞培养,动物细胞融合,单克隆抗体技术,核移植,动物细胞工程常用技术,其它动物细胞工程的基础,-,5,一、动物细胞培养的应用和概念：,1、概念：动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖.,2、原理：细胞增殖,-,6,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬浮液,10代细胞,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液,3、过程,-,7,（1）细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上（单层）。要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。,（2）接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。,动物细胞培养特点：,贴壁生长、接触抑制,解答概念,-,8,细胞贴壁过程,培养瓶或培养皿壁要求：表面光滑、无毒、易于帖附。,-,9,(3)原代培养(primaryculture),定义：指将要培养的动物细胞取出后，先用胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞，然后配制成一定浓度的细胞悬液，再将该悬液放入培养瓶中培养。,过程：从动物机体中取出组织剪碎加胰蛋白酶细胞游离制成细胞悬液将细胞接种到培养瓶内培养（1-2天换一次培养液）细胞贴壁生长长成单层细胞,-,10,定义：当原代培养的细胞生长停止，这时如果要使细胞继续生长，就要及时用胰蛋白酶等，使细胞从瓶壁上解离下来，然后加入新的培养液，将细胞分离稀释，并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内，这个过程称传代培养,(4)传代培养(subculture),-,11,细胞株：传代细胞一般能传到40-50代，遗传物质一般不会发生改变，叫细胞株。,强调：细胞系、细胞株（了解即可，老课本体系）,细胞系：传代50代以后不能再传下去，部分细胞遗传物质发生了改变，能连续传代，获得不死性，叫细胞系。,细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,-,12,知识点小结：各个新名词之间的联系,遗传物质改变,-,13,1、无菌、无毒的环境（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2、营养（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清、微量元素等）3、温度和PH温度36.5+0.5度，pH7.27.44、气体环境O2和CO2（95%空气和5%CO2）,4、动物细胞培养条件,保证细胞顺利的生长增殖,能否用胃蛋白酶代替胰蛋白酶？,-,14,无菌操作,培养箱,-,15,问题3：为什么用胰蛋白酶处理？,问题1：、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？,因为其细胞生命力旺盛，分裂能力强，分化程度低。,问题2、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？,扩大细胞与培养液的接触面积，利与细胞吸收营养。,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，胰蛋白酶处理动物组织，可以使动物组织细胞间的蛋白质和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞。,问题4：为什么用胰蛋白酶处理而不用胃蛋白酶？,动物细胞培养的最适PH值为7.2-7.4，胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2-8.4，胃蛋白酶适宜PH为2.胃蛋白酶在PH为7.2-7.4的动物细胞培养中无活性。,问题5：用胰蛋白酶处理不会把所培养的细胞消化掉吗？,控制好时间！长时间处理当然会损伤细胞。,-,16,问题6、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？,问题7、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？,主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、无机盐）、维生素和动物血清等。独特之处有：1、液体培养基2、成分中有动物血清等,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体,问题8、动物细胞培养的原理：,细胞增殖。,问题9、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在10代以内，为什么？,10代以内的细胞遗传物质不改变，保持正常二倍体核型。,-,17,5.动物细胞培养技术的应用:,1.蛋白质生物制品的生产如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体2.应用于基因工程主要用于作为受体细胞3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性4.细胞的生理、药理、病理研究如用于筛选抗癌药物,-,18,6、植物组织培养和动物细胞培养的比较：,-,19,复习回顾,1、动物细胞培养的过程、特点及原理？2、植物组织培养与动物细胞培养的比较？,-,20,多莉羊的培育过程,无性生殖,-,21,二、动物体细胞核移植技术和克隆动物,1、定义：动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体.,3、分类：胚胎核移植、体细胞核移植。,胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易。,动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难,2、原理：动物细胞核具有全能性,-,22,4、体细胞核移植过程-示动物克隆-无性繁殖,1.）克隆羊多利培育过程：,另一头绵羊的子宫,特别注意：克隆动物性状与供体动物完全一样吗？,不可能！因为：一、供体动物只提供细胞核，而细胞质中的遗传物质（如线粒体DNA）来自于受体卵母细胞.二、生物的性状不仅与遗传物质有关，还受环境的影响。,供体,受体,代孕受体,-,23,取供体细胞传代培养10代以内的细胞.为什么？,用的是去核的减数第二次分裂中期细胞（M中期）为什么？,激活方法：激活目的：,促融方法：电刺激,胚胎移植至代孕受体内,妊娠、分娩,2.）核移植流程,供体：优质高产奶牛,受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养）,1.体积大，易操作。2.含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。,有人说它三个母亲，对吗？,-,24,供体细胞（供核）,细胞培养,体细胞,卵巢卵母细胞（M中期：供质）,去核,无核卵母细胞,注入,细胞融合,重组细胞,构建重组胚胎,胚胎移植,代孕母体,生出与供体奶牛遗传基础相同的犊牛,归纳:1.共分成两大阶段：核移植和胚胎移植2.取卵细胞作受体细胞的原因是:它是最大的细胞,易操作,它发育可直接表达性状3.严格来说新个体有卵巢母细胞的细胞质所以有两个亲本的性状,小结：核移植过程,-,25,5.体细胞核移植技术的应用前景,-,26,克隆动物的研究意义,1.克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白2.加速改良动物品种3.治疗人类疾病提供供体（器官、细胞、组织）4.保护濒危动物,体细胞核移植技术存在的问题,1.许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，免疫失调等。2.成功率非常低3.克隆动物食品的安全性问题。,-,27,2-2动物细胞融合与单克隆抗体,-,28,一、动物细胞融合（细胞杂交）,1、概念：,指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。,2、结果:,形成单核的杂交细胞,3、原理：,细胞膜的流动性,4、诱导方式：,物理法：离心、振动、电激,化学法：聚乙二醇（PEG),生物法：灭活的病毒,-,29,细胞融合是正常的生命活动,两个细胞正在融合,受精作用,-,30,诱导融合的方式生物法：灭活的病毒诱导融合.(利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。这是由于病毒的磷脂外衣与动物细胞的膜十分相似的缘故。病毒外壳上的某些糖蛋白可能还有促进细胞融合的功能。)化学法：聚乙二醇PEG诱导融合.物理法：电激融合,病毒颗粒黏附细胞表面,细胞膜连接,细胞膜被病毒颗粒穿通,细胞融合、形成杂种细胞,-,31,5、过程：,动物细胞A动物细胞B,诱导，融合,1个完整的杂交细胞AB,（膜融合、质融合）,（核融合）,细胞融合完成的标志:细胞核融合成一个核,-,32,6、意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。,7、应用：成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。,最有价值的应用,制备单克隆抗体,-,33,动物细胞融合,杂种细胞,愈伤组织,杂种植株,植物细胞A,植物细胞B,原生质体A,原生质体B,植物体细胞杂交,去壁,原生质体融合,植物组织培养,物理法,化学法,生物法：灭活的病毒,常用方法,-,34,主要用于制备,单克隆抗体,获得杂种植株,用途,物理、化学方法,（同左）,灭活的病毒,物理（离心、振荡、电刺激）,化学（聚乙二醇）,诱导方法,使细胞分散后诱,导细胞融合,去除细胞壁后诱,导原生质体融合,细胞融合的方法,细胞膜的流动性,细胞膜的流动性、,植物细胞全能性,原理,动物细胞融合,植物体细胞杂交,比较项目,植物体细胞杂交、动物细胞融合的比较,-,35,1.动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于-（）A.培养基不同；B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培养成植株。,A,课堂练习：,-,36,2、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是-（）A细胞系B细胞株C原代细胞D传代细胞,3、动物细胞工程技术的基础是-（）A.动物细胞融合B.单克隆抗体C.胚胎移植D.动物细胞培养,A,D,-,37,4、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞（）A.容易产生各种变异B具有更强的全能性C.取材十分方便D分裂增殖的能力强,D,-,38,5.下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此回答：（1）容器A中放置的是动物器官或组织。它一般取自_。（2）容器A中的动物器官或组织首先要进行的处理是，然后用酶处理，这是为了使细胞分散开来，这样做的目的是（3）培养首先在B瓶中进行，瓶中的培养基成分有_等。,幼龄动物或胚胎的组织或器官,剪碎组织,胰蛋白,使细胞与培养液充分接触,葡萄糖、氨基酸、水、无机盐、促生长因子与微量元素和动物血清,-,39,在此瓶中培养一段时间后，有许多细胞衰老死亡，这是培养到第代，到这时的培养称为_。为了把B瓶中的细胞分装到C瓶中，用处理然后配置成，再分装。在C瓶中正常培养了一段时间后，发现细胞全部死亡，原因是,10,原代培养,胰蛋白酶,细胞悬液,细胞没有发生癌变,相互接触,接触抑制,单层（或一层）,胰蛋白酶,衰老甚至死亡,不死性,降低,减少,子宫,细胞核,重组胚胎,去核,-,42,-,43,二、单克隆抗体,什么是抗体？由何种细胞产生？主要分布在哪里？起何作用？,效应B细胞,血清,特异性免疫作用,抗体：机体受抗原刺激后产生的，并且能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。,-,44,克隆,概念：是指从一个共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生出来的一群遗传特性相同的DNA分子、细胞或个体不同层次的克隆：a.分子水平：如DNA的复制b.细胞水平：动物细胞的培养c.个体水平：“多莉”羊的产生,-,45,接受抗原刺激后，能分泌针对该抗原的特异性抗体，在体液免疫中具有重要功能。B淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间后便会死亡短命细胞,B淋巴细胞,所以B淋巴细胞在体外培养时不能无限增殖，而癌细胞是可以无限增殖的。,-,46,骨髓瘤细胞,恶性增殖的转化细胞，只要营养条件适合可永远分裂和存活长命细胞。经筛选与驯化，现已建立多种骨髓瘤细胞株没有抗体分泌物。,因此可以利用小鼠骨髓瘤细胞与之融合，就可获得既能无限增殖又能产生单一抗体的细胞。,-,47,单克隆抗体的制备极富创造性的方案将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。米尔斯坦(阿根廷)和科勒(德国)因此在1984年获诺贝尔奖。,-,48,特点：产量低、特异性差、纯度低、反应不够灵敏,1、常规抗体制备,一个B淋巴细胞：只分泌一种特异性抗体,2、单克隆抗体,杂交瘤细胞,小鼠骨髓瘤细胞：能无限增殖,融合,向动物体内反复注射抗原，使动物产生抗体，然后从血清中分离所需抗体。,优点：特异性强，灵敏度高，可大量制备。,-,49,B淋巴细胞,注射特定抗原蛋白,骨髓瘤细胞,培养骨髓瘤细胞,融合,多种杂交细胞,在具有筛选作用的培养基上培养,专一抗体检验阳性,克隆上述杂交细胞,分开不同杂交细胞，克隆专一抗体，检验阳性细胞,单克隆抗体,注射到小鼠体内,体外培养,3、单克隆抗体的制备过程,第1次筛选目的：得到杂交瘤细胞（多种）。,第2次筛选目的：在杂交瘤细胞中筛选出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。,该细胞继承双亲细胞的遗传特性，既能产生专一抗体又能无限增殖。,杂交瘤细胞有何特点？,特异性强，灵敏度高,-,50,原理：杂交瘤细胞具有两个亲本的特性，即能迅速大量增殖，又能产生足够数量的单一抗体。,过程,B淋巴细胞骨髓瘤细胞,诱导融合,B-B细胞,B-瘤细胞,瘤-瘤细胞,选择培养,杂交瘤细胞（B-瘤细胞）,克隆化培养,抗体检测,杂交瘤细胞,体外培养,单克隆抗体,-,51,（1）为什么用小鼠骨