大肠杆菌分子克隆载体PPT课件

第三节大肠杆菌分子克隆载体，一、E.coli克隆载体种类1 .质粒载体复制起点来源于一些天然质粒。 2 .噬菌体载体-，P1和13，fd载体，复制起点来自噬菌体。 3.COS质粒载体-在质粒载体中插入cos片段，有4.phagemid质粒载体和13.FD复制起点，可以用质粒载体或噬菌体复制。二、质粒和质粒载体1.E.coli的质粒种1)colE1因子(大肠菌素因子)多为不能结合转移的DNA，是高拷贝松弛型。 2)R因子(耐药因子)可以结合转移DNA，低拷贝严格型，质粒大，操作不方便3)F因子(性因子)，2 .质粒的特征1 )质粒DNA的复制与染色体复制无关2 )质粒DNA以超螺旋形式存在3 )质粒DNA转移质粒的不兼容性和不兼容组可结合5 )质粒DNA的去除化学和物理法(吖啶染料、EtBr高温等)6)质粒的综合-f因子是E.coli染色体中3 .质粒DNA的转移1 )质粒DNA的转移过程、质粒的自主转移过程、质粒DNA的转移和复制2 ) 质粒DNA转移的必要条件I .转移起点(oriT )是质粒DNA转移时的转移起点cis-action)ii .由细胞附属物性纤毛蛋白构成的传递机构iii .转移过程所需的所有酶类-传递机构3 ) 质粒转移型.自转移(self-transmission)ii.辅助转移(Donation)可转移质粒仅为oriT，没有辅助质粒前者不结转移。 当辅助质粒能够提供所有反式作用蛋白质时，前者会发生结合转移。 iii .重组转移(conduction)如果质粒没有oriT，该质粒只需与辅助质粒DNA结合，重组质粒就能转移。 因此，用于克隆外源DNA的分子克隆载体可以具有oriT，其它两种功能基因可以位于辅助质粒上，因为该质粒通常没有oriT，后者进入另一细胞的频率可以降低。质粒的自主转移、质粒的辅助转移、质粒的重组转移、R-重组DNA分子、4 .质粒DNA的复制和调节控制1 )复制机制、复制方向、终止和方式2 )质粒复制数的控制剂模型：高复制质粒需要高浓度抑制剂，低复制质粒需要高浓度抑制剂3 )质粒复制控制机制实例：ColE1质粒复制和复制起点结构borosetal.(1984 )分离为pbr 322突变体，其复制数达到1000/cell或65%。 因为在RNAI基因的3个末端附近发生了GT置换。 ColE1质粒复制起点结构，质粒DNA的复制过程5 .大肠杆菌质粒载体1 )常用质粒载体的复制因子载体的复制因子数pBR322系列pMB115-20pUC系列pMB1500-700pACYC系列p15A10-12pSC101系列质粒载体中常用的遗传标记基因aprcmrkanrneortcrhygrlaczlacz3 )多克隆位点区多数来自pucch系列的多克隆位点， 6 .例pUC18和pucch19pucch系列质粒载体由Messingetal .构建，具有3个显着特征：1)分子量小，收容外源DNA的量增加2 )插入外源DNA的标记基因LacZ3 多克隆部位区域I .多克隆部位成对存在于pUC18和pUC19中，部位的排列顺序相同，但方向相反。 该序列方式有利于外源DNA的克隆和定向插入。 不同端规则序列：两端限制酶部位的产生5突端(EcoRI和Hind)，相邻两个限制酶部位的产生3突端(SstI、KpnI、SphI、PstI )，中央四个限制酶部位的产生5突端或平板端。 该序列方式对插入DNA片段的单方面缺失和缺失片段的回收非常有利。 另外，pUC18和pUC19的载体，例如插入片段的5段的方向性为： xbaisphiexo iiiS1t4dnalingase； 插入片段的3末端也可以按照同样的方法缺失(smaisstiexo iiis 1t4dnalingase )。而且，显然的是，例如：pBS的多克隆部分区域的排列次序(参见附图：要求在其3端或5端连接另一个DNA片段(例如终结器，启动子)，假设存在ecorihindiiiDNA片段) iii .多克隆站点集中布置，有利于克隆片段的物理图像的创建。 除上述3个特点外，pucch系列载体也可用于表达外源基因(LacZ启动子)。pBS载体的结构、3 .噬菌体载体1 .噬菌体载体1)的结构和特征I .一般结构： 48， 502bp，线状ds-DNA，两端具有12n.t5-突起(5- gggcgggggcgacct-3)的末端被称为cos位点的末端的2个基因Nul、由a编码蛋白质gpNul和gpA构成的编码末端酶识别的ii .基因结构-46基因I ) CI、Cro、c-质粒载体形式决定细菌细胞存在且强噬菌体形式可复制)DNA复制： int、xis、red、gamiiv )噬菌体粒子的形成与细胞分裂：头(A-F )、尾(E-J )、 Sii .决定细菌细胞中存在低拷贝质粒形式)DNA复制： int、xis、red、gam)噬菌体粒子的形成和细胞分裂：头(A-F )、尾(E-J )、 Sii. iii.P1噬菌体包装原理：渐进头机制(processiveheadfulmechanism )基质：的辊转移过程中形成的头串联体的包装过程3360从长度为162bp的P1pac部位开始， 识别并切断该部位的是P1码的pacase，切断的pac的一端进入预制器头部，其头部充满DNA后，再次切断DNA。 第二次切割无随机特异性DNA序列。 第二次包装从非特异性切出的末端开始。 因此，多次包从pac站点开始。 一只p是110Kb。 pac部分：的一端包括四个六聚物(5TG atca/g3)，另一端三个，中间区域的长度为90bp，而pacase触点位于接近90bp区中心的序列中。 每个六聚体都有腺嘌呤的甲基化部位(damGATC )，pacase只作用于甲基化的pac部位.大肠杆菌P1噬菌体的基因组和包装.2)P1载体-pad10SSSXacbii .优点I )可克隆较大的插入片段，95Kb cos质粒载体ii的2倍)的高转换频率下，12g载体24g外源DNA105转化子iii )与YAC载体相比，容易得到容易生成多拷贝的基因组片段的大量特定克隆DNA的克隆制作过程的可靠性提高克隆片段第二克隆ii .结构载体由两个loxP重组区域组成： Ampr和Kanr区域Ampr区域：来自pBR322的ori、pac区域(逆时针包装)、来自腺病毒的11Kb填充片段(插入Sca区域) Kanr区域： Kanr(Tn903 )和Tetr P1质粒复制体和分离体系，P1分裂复制体的活性由lac操作基因启动子控制，大肠杆菌P1噬菌体载体pad10SSCBii、P1噬菌体载体构建基因库的图像， pad10SCBscaibbamhi臂短臂加入外源DNA片段重组DNA分子感染宿主细胞、含该基因的细胞在2%以上蔗糖培养基中培养时，果糖会积累在细胞周质空间中， 引起大肠杆菌细胞死亡的SacB基因克隆到原Tetr基因的BamHI-SalI之间，在其上游附加了E.coli基因启动子，克隆部位BamHI位于这两个DNA片段之间，在插入外源DNA片段时使SacB基因的自发突变最小化表达P1C1基因的细胞阻碍了sacB基因的表达，在无蔗糖条件下，该细胞生长更好的iii .克隆策略3.3kb的短臂： pac、loxP、无启动子的sacB26kb的长臂：为P1分解复制子、Kanr、P1质粒复制子， 包含loxP部位的包装：重组DNA分子首先用pacase或提取物I酶切断pac部位，然后用提取物ii (包括头部和尾部)包装直至头部充满DNA，最后连接到尾部有感染力的重组P1噬菌体粒子。iV .重组DNA分子在重组DNA分子进入宿主细胞后，特异性部位的重组在两个方向上发生在同一loxP部位，该过程中宿主细胞中表达的重组酶(Cre )为v .宿主菌E.coliNS3529株基因型recA-、lacq、mcrABC， lacq:可防止mrr:recA-:插入DNA片段中的同源重组，防止重排，抑制p-1分解复制子的活化，使p-1质粒复制子作为单拷贝存在于细胞中， 防止外源DNA分子转位的mcr和mrr:抑制了富含GpMeC或ApMeC的插入片段的选择性丢失，3.M13和fd载体1 )的结构特征环状ssDNA病毒粒子为线状2 )的复制过程： ss () RF (0-1min ) rfrf (0- 20min ) rfss () (20min)DNA包装没有限制3 )生存史a .病毒粒子是小分子内酰胺和a蛋白质，性纤毛前端(E.coli中f因子提供) b .病毒DNA和a蛋白质进入细胞内，大部分内酰胺残留在细胞膜上的c .病毒DNA成为双链复制形式(RF ) 氯胺为DNA复制提供附着部位d.RF，形成单链的同时，基因和蛋白质结合，e.ssDNA环化，线状的DNA基因和蛋白质复合体f .病毒DNA穿透膜，基因和蛋白质被膜上附着的衣原体所置换， 完整病毒从细胞中释放出来时不杀死细胞，但由于感染细胞生长缓慢，仍然可见斑块，13噬菌体的生存史，1 )基因结构基因I、iv和vii编码特异蛋白质参与病毒粒子的组装基因ii为DNA复制基因iii， 编码viii和ix的13个结构蛋白基因v参与单链复制过程的环化作用基因vi是克拉米的重要组成部分2)M13mp系列的载体a .特征：在IR区插入lacZ基因，在该基因中构建多克隆区， ds-DNA可以通过通常的方法直接导入ss-DNA的常用感染法斑块的形成形成用于选择导入DNA的细胞，在X-Gal平板上形成的无色斑块中检测重组子b的优点： ss-DNA用于DNA序列测定和基因变异， 4.COS质粒载体1 .结构特征：在普通质粒载体中插入一个或两个来自的cos部位片段， 双COS载体比单COS载体lCOS位点的微结构COS长200bp，由以下亚基组成： a.cosN端酶的gpA亚基识别和截断，位于产生5-12n.t突起的b.cosbcosn两侧，cosBL (左侧)和cosBR (右侧) R1，R2和R3的长度为16bp，其中有12个n.t相等，可以与gpNul蛋白体外结合。 R4与上述3个r片段仅8个n.t相等，不能与gpNul蛋白体外结合，但可与全酶结合(ATP存在时)。 I-1为IHF结合部位。 COS位点结构，2 .优点I .容量大(达48kb )，用于基因簇克隆ii .形成的重组DNA分子可体外包装，可感染E.coli细胞(由于细胞内不能形成噬菌体粒子，不能形成斑块) iii .操作简便， 细胞iv .重组DNA分子的长度可选择性包装3 .遗传标记：