荧光显微镜PPT课件

.,1,Fluorescencemicroscopy,.,2,Mainlyfluorescencedetectorsystemsarecolor-blind!,(Colorsarebasedonapseudo-colorlook-uptable),.,3,荧光显微镜,.,4,荧光显微镜的优点和用途,优点：检出能力高对细胞的刺激小能进行多重染色用途：物体构造的观察荧光的有无、色调比较进行物质判别发荧光量的测定对物质定性、定量分析,.,5,什么是荧光?,物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。一种光化荧光,.,6,Basicideaoffluorescencemicroscopy:Stokesshift,.,7,荧光的种类,.自发荧光（不加染色）;.二次荧光（用化学染色）;.抗体荧光技术（用免疫染色）;,.,8,自发荧光：有些物质不加染色，也能发出荧光（自发荧光或原发荧光），但在医学和生物学领域中，只有很少物质具有自发荧光。,激发光,发射光,.,9,二次荧光（用化学染色）,非荧光性的物质（蛋白质、炭水化合物）用荧光色素染色，由荧光色素产生荧光（二次荧光），以便进行观察。对特定物体选择合适的荧光色素，该物体就能和周围的组织或细胞区别出来而可以观察到。,.,10,抗体荧光技术（用免疫染色）:,利用特定的抗原必然和特定的抗体相结合这一个事实，有意识地使带荧光标记的抗体和标本中的抗原进行抗原/抗体反应，这样两者的结合体就能通过抗体的荧光观察到。,.,11,荧光的性质,吸收光保持固有的荧光特性荧光波长激发波长（STOKES法则）荧光强度极小于激发光的强度有不同程度的衰减荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率,.,12,荧光显微镜的种类透射式落射式,.,13,荧光显微镜的主要部件,透射式汞灯光源激发滤色镜暗场聚光镜吸收滤色镜,落射式汞灯光源激发滤色镜分色镜吸收滤色镜,.,14,暗视野照明方式,聚光镜中央有档光片，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。,.,15,darkfieldwithoutspecimen,objectplane,objective,condensor,Brightanddarkfieldillumination,-ringdiaphragm(usually)-darkfieldcondensor,darkfieldwithspecimen,.,16,Brightanddarkfieldillumination,Brightfieldtotalilluminationofthespecimendirectlightcollectionbyobjectivedark/coloredobjectonbrightbackground,Objectswithhighcontrast,(withmodificationhttp:/mikroskopie.de),.,17,透射荧光显微镜的构造,吸收滤色镜,暗场聚光镜,激发滤色镜,汞灯箱,.,18,落射荧光显微镜的构造,吸收滤色镜激发滤色镜,分色镜,汞灯,紫外线保护罩,孔径光栏（FS）视场光栏（AS）,.,19,.,20,Immersionobjectives:Remembertherefractionindex!,Immersionobjectivewithspecimen,refractionindex(n)air1.00water=1.37oil=1.5glass=1.5,.,21,透射荧光显微镜,优点：,由于用了暗场聚光镜，激发光不能进入物镜，因此容易形成暗的背景，得到良好的反差。由于上述同样的原因，任何物镜都可用于观察。用低倍物镜时，比反射荧光显微镜更亮。,.,22,透射荧光显微镜,缺点：,必须正确调整聚光镜中心和高度，否则不能获得明亮的荧光像。由于暗视场聚光镜焦距限制，不能使用厚的载玻片。视场照明区不能过大，否则容易使荧光标本荧光色衰褪。厚的或不透明的标本不适用。,.,23,反射荧光显微镜,优点：,由于物镜兼作聚光镜，不需要很多调节。采用柯拉照明法，可利用孔径光阑和视场光阑的效果。物镜数值孔径不受限制，在高放大被率时，也可以获得高分辨率的像。厚的或不透明的标本也能观察，厚的盖玻片也能使用。其它观察法也能与反射荧光结合使用，特别和相差法和透射微分干涉差法相结合。可以避免不必要的荧光色衰褪现象。,.,24,反射荧光显微镜,缺点：,在用低倍率物镜时，像比较暗，因此必须用大数值孔径的物镜。滤光镜系统必须有效地分离开激发光和荧光。,.,25,落射荧光显微镜各部件特性和作用,汞灯光源:提供激发光(U、V、B、G),激发滤色镜:波长选择,nm,T%,BANDPASS,.,26,落射荧光显微镜各部件特性和作用,吸收滤色镜:透过荧光,阻挡杂光,分色镜:反射激发光,透过荧光,A透过,A,A反射,B,B透过,B阻挡,nm,nm,T%,T%,.,27,落射荧光显微镜原理,汞灯,激发滤色镜,分色镜,吸收滤色镜,物镜,标本,.,28,透射荧光显微镜原理,目镜,吸收滤色镜,物镜,暗场聚光镜,激发滤色镜,汞灯,.,29,滤色镜的选择,荧光素的特性,滤色镜的特性,激发,分色,吸收,根据荧光素和滤色镜的特性选择滤色镜,.,30,激发滤色镜的选择,激发滤色镜,吸收滤色镜,FITC吸收,FITC发射,分色镜,-激发滤色镜的带宽应尽量符合荧光色素的特性,.,31,激发滤色镜带宽对图象的影响,SWB:BP420-480,WB:BP450-480,WIB:BP460-490,NB:BP470-490,FITC+PI,.,32,多重染色标本的多色观察,DAPI+FITC+TexasRed,-选用特制的多色滤色镜,.,33,三色滤色镜的特性曲线,激发,分色,吸收,.,34,双重染色标本的单色和双色观察,NUA,WIB,DUALBAND(特制）,WIBA,WIG,WIB,DAPI+FITC,FITC+PI,-选用单色和双色滤色镜,.,35,单色滤色镜的特性曲线,.,36,双色滤色镜的特性曲线,.,37,现行荧光显微镜特点和各种滤色镜,激发/分色/吸收一体化-CUBE同时安装4组或6组CUBE(另可提供8组型)数十种通用和专用CUBE供选择,.,38,FreeCube,吸收滤色镜,激发滤色镜,分色镜,根据需要随意选择各种波长滤色镜,.,39,早期荧光显微镜,.,40,早期荧光显微镜附件,有很多辅助滤色镜,.,41,早期荧光滤色镜特点,宽带激发,.,42,辅助激发和辅助吸收滤色镜的特性,.,43,辅助激发滤色镜的运用,.,44,辅助吸收滤色镜的运用,激发,分色吸收,荧光,辅助吸收,杂光,nm,T%,.,45,油镜应使用荧光油,.,46,物镜光栏的运用,光栏全开启,光栏适当关小,物镜光栏,适当调节物镜光栏以获得最佳效果,.,47,荧光的衰减,防衰减的方法使用抗衰减剂选择衰减小的荧光素降低激发光强度降低标本中氧的浓度,有衰减的标本,.,48,使用抗衰减剂的效果,.,49,广泛应用的抗衰减剂,.,50,使用要点,标本制作选用荧光物镜正确选择滤色镜调节光源中心油镜应使用荧光油光栏物镜应适当调节物镜光栏适当调节孔径光栏和视场光栏,.,51,各种汞灯灯箱,.,52,汞灯中心调节方法,放置一张白纸于载物台上转入B激发滤色镜用10X物镜观察并聚焦白纸取下10X物镜通过汞灯箱上聚焦旋钮聚焦汞灯电极于白纸通过汞灯箱上下、左右旋钮调汞灯电极中心于白纸上圆环中心,.,53,5、荧光显微镜的结构和普通显微镜有何区别？答：1）荧光显微镜要有一个能产生高能紫外线的光源。一般采用汞灯或氙灯作紫外光源，也有用溴钨灯的。（1分）2）紫外光源因其功率较大(100w以上)尤其是汞灯和氙灯所需要的电压离达上千伏，一般都专门设一个电源箱来供电。（1分）3）从光源灯到标本之间，紫外线所经过的所有