生科第五章酶ppt课件

.,第五章酶（Enzyme）,酶的概念与特点,酶的分类与命名,酶的化学本质与组成,酶的专一性,酶的作用机制,影响酶促反应速度的因素,酶活力的调节,酶的研究方法与酶工程,酶促反应动力学,.,6.1酶的概念与特点,定义：酶是具有高效性与专一性的生物催化剂（Biocatalyst）。,酶具有一般催化剂的共性：1.本身不被消耗；2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；3.通过降低活化能加快化学反应速度。,.,1.高效性：通常要高出非生物催化剂催化活性的1051017倍。2.专一性：酶对底物具有严格的选择性。3.敏感性：对环境条件极为敏感，易失活。4.可调性：酶活性的调节和酶合成速度的调节。,酶的特点,1mol过氧化氢酶5106molH2O21mol离子铁610-4molH2O2,.,6.2酶的化学本质与组成,（一）化学本质大多数酶是蛋白质,1926年J.B.Sumner首次从刀豆制备出脲酶结晶，证明其为蛋白质，并提出酶的本质就是蛋白质的观点。,酶是蛋白质的证据：酶的热不稳定性；酶是两性电解质；引起蛋白质变性的物理化学因素同样使酶活性丧失；酶具有胶体性质；经蛋白水解酶作用丧失活性；多次重结晶，其均一性和活力不改变；许多酶的AA序列已被测定。,.,1982年，T.Cech发现了第1个有催化活性的天然RNAribozyme（核酶），以后Altman和Pace等又陆续发现了真正的RNA催化剂。核酶的发现不仅表明酶不一定都是蛋白质，还促进了有关生命起源、生物进化等问题的进一步探讨。,.,（二）酶的化学组成,酶,单纯酶,结合酶,（全酶）(holoenzyme),辅因子（cofacter),辅酶（coenzyme）:与酶蛋白结合得比较松的有机小分子。,辅基（prostheticgroup）：与酶蛋白结合得紧密的有机小分子。,金属激活剂(metal-activatedenzyme)：金属离子作为酶活性部位的组成成分。,酶的催化专一性主要决定于酶蛋白部分，辅因子通常是作为电子、原子或某些化学基团的载体。,辅因子(cofactor)：非蛋白组分；决定反应类型、性质,脱辅酶(apoenzyme)：多肽；决定特异性、高效性,.,（三）酶的类型,1.单体酶（monomericenzyme)：仅有一条具有活性部位的多肽链，全部是水解酶。,2.寡聚酶(oligomericenzyme)：由几个或多个亚基组成。亚基之间以非共价键结合，单个亚基没有催化活性。,3.多酶复合体(multienzymesystem)：几个酶彼此嵌合形成的复合体。有利于反应进行，提高酶的催化效率，便于机体对酶的调控。,.,1、氧化还原酶（oxidoreductase）2、转移酶（transferase）3、水解酶（hydrolase）4、裂解酶（或裂合酶lyase）5、异构酶（isomerase）6、合成酶（synthease）,6.3酶的分类与命名,1961年，国际酶学委员会（EnzymeCommittee,EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：,.,1.氧化还原酶类：主要催化氧化还原反应。,AH2+B（O2）,A+BH2（H2O2，H2O）,主要包括脱氢酶类、氧化酶类、过氧化物酶、加氧酶。如：乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。,.,2.转移酶类：催化化合物中某些基团的转移。,AX+B,A+BX,根据X分成8个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。,.,例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应,3.水解酶类：催化水解反应。,AB+H2O,AOH+BH,.,4.裂解酶类：催化非水解性地除去底物分子中的基团的反应或逆反应。,CC键,+CO2,CO键,+H2O,AB,A+B,CN键,+NH3,.,5.异构酶：催化各种异构体之间的互变。,常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类。例如，6-磷酸葡萄糖异构酶。,.,6.合成酶类：与ATP的一个焦磷酸键断裂相偶联，催化两个分子合成一个分子的反应。,例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸+CO2草酰乙酸,.,酶的分类编号：EC+四个数字,.,系统名：包括所有底物（Substrate）的名称和反应类型。,乳酸+NAD+,丙酮酸+NADH+H+,乳酸：NAD+氧化还原酶,惯用名：简短、方便，常以底物名、反应性质以及酶的来源命名；只取一个较重要的底物名称和反应类型。谷丙转氨酶,乳酸：NAD+氧化还原酶,乳酸脱氢酶,水解酶一般省去反应类型；区别同一类酶可标上来源。,酶的命名,.,6.4酶的专一性(specificity),专一性,结构专一性,立体异构专一性,族（基团）专一性,绝对专一性,一、类型,相对专一性,键专一性,绝对专一性：只能作用于某一底物。,.,族专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。,键专一性：作用于底物特定的化学键。,结构专一性,.,立体异构专一性,酶对立体异构体具有高度专一性。只能催化一种立体异构体发生化学反应，对另一种异构体无作用。例如：L-乳酸脱氢酶催化L-乳酸脱氢。延胡索酸酶：作用于反式的丁烯二酸。,.,二、酶专一性假说,1.锁钥学说(lockandkeyhypothesis.Fischer，1890）酶的活性中心结构与底物的结构互相吻合，紧密结合成中间产物。2.诱导契合学说（inducedfithypothesis（Koshland，1958）酶活性中心的结构有一定的柔性，当底物与酶分子相遇时，诱导酶蛋白的构象发生相应变化，使活性中心的催化基团和结合基团正确地排列和定向，使酶与底物契合，结合成中间产物。,.,酶-底物结合方式：诱导契合,.,能垒:反应物分子发生化学变化所需最低能量。活化分子:含有高于反应能垒而能起反应的分子。活化能:分子由常态转变为活化状态所需的能量。,供给能量，如加温、光照等。使用催化剂，降低活化能。,加快反应速度的方法：,几个概念：,6.5酶的作用机制,（一）酶的催化作用、过渡态、分子活化能,.,一般催化剂反应活化能,反应总能量变化,酶促反应活化能,非催化反应活化能,初态,终态,能量改变,活化过程,酶促反应降低活化能，使活化分子数增多，反应速度加快。,过渡态,.,二、酶和底物复合物的形成,E+S,ES,E+P,中间产物存在的证据：吸收光谱法（过氧化物酶与过氧化氢结合）。H2O2+AH2A+2H2O过氧化物酶+H2O2过氧化物酶.H2O,S,P,.,一、酶的活性部位,必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。,活性部位(activesite)：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。,必需基团,活性部位,维持酶的空间结构,结合基团,催化基团,专一性,催化性质,.,亲核性基团：丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基。酸碱性基团,常见必需基团,.,.,底物,活性中心以外的必需基团,结合基团,催化基团,活性中心,.,（四）酶与反应的过渡态互补,过渡态理论：酶与底物的过渡态互补，亲合力最强，释放出结合能使ES的过渡态能级降低，有利于底物分子跨越能垒，加速酶促反应速度。,（五）抗体酶（abzyme）,既是抗体又具有催化功能的蛋白质，是具有催化活性的抗体。,.,三、酶具有高催化效率的分子机制,1.邻近效应和定向效应指底物与酶的活性中心相互靠近。底物分子间及底物和酶活性中心的基团之间要有严格的定向。提高了底物的有效浓度，使分子间反应近似于分子内的反应。反应活化能降低，增加了中间产物进入过渡态的几率。,.,+,-,+,-,稳定的底物,通过电荷等相互作用，底物张力变形激活形成过渡态,张力效应（strain）,-,-,+,+,“张力”与“形变”：酶与底物的结合，不仅酶分子发生构象变化，同样底物分子也会发生扭曲变形，促进中间产物进入过渡态。,2.促进底物过渡态形成的非共价作用,.,3.酸碱催化,酶活性中心上的某些基团可以作为良好的质子供体或质子受体对底物进行酸碱催化。蛋白质中起酸或碱催化的功能基团有氨基、羧基、咪唑基、巯基和酚基。,4.共价催化底物分子与酶分子生成不稳定的共价中间物，再进一步生成产物，快速完成反应。,.,Glu270,Tyr248,Arg145,底物,羧肽酶结合底物前后构象变化,.,羧肽酶活性中心必需基团与底物间的结合,.,溶菌酶-底物复合物,A,B,C,D,E,F,酶切位点,.,溶菌酶活性中心与底物结合示意图,Asp52,Glu35,（极性区）,（非极性区）,.,七、酶促反应动力学,一、酶反应速度的概念,用一定时间内底物的消耗量或产物的生成量来表示酶促反应速度。测定反应的初速度。,在有足够底物和其他条件不变的情况下：v=kE,.,二、底物浓度对酶作用的影响,1.底物浓度对酶反应速度的影响,一级反应v=kS,零级反应v=kE,.,当底物浓度较低时,反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。,.,随着底物浓度的增高,反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。,.,当底物浓度高达一定程度,反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应,.,用中间产物学说解释底物浓度与反应速度关系曲线：,当底物浓度很低时，有多余的酶没与底物结合，随着底物浓度的增加，ES数量不断增高，反应速度随之增加。当底物浓度较高时，溶液中的酶全部与底物结合成中间产物，虽增加底物浓度也不会有更多的ES生成，所以反应速度几乎不变。,.,2.米氏方程式（Michaelis-Mentenequation）用于表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的方程式。,当kmS时，v=(Vmax/Km)S,即v与S成正比。当kmS时，vVmax，即S而v不变。,Km米氏常数Vmax最大反应速度,.,米氏方程的推导,令：,将（4）代入（3），则：,ES生成速度：,，ES分解速度：,即：,则：,由于酶促反应速度由ES决定，即,将（2）代入（1）得：,(3),当酶反应体系处于恒态时：,当Et=ES时，,.,当反应速度为最大反应速度一半时，v=Vmax/2，,KmS,1.Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。,.,km=（k2+k3)/k1,当k2k3时，Kmk2/k1,km可以表示酶和底物的亲和力。,2.km大，说明ES容易解离，酶与底物结合的亲和力小。,.,3.米氏常数的测定,通常用Lineweaver-Burk作图法（双倒数作图法）,（y=ax+b）,斜率=km/Vmax,1/Vmax,-1/km,.,米氏常数的意义,当v=Vmax/2时，Km=S。Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。是酶在一定条件下的特征物理常数，其大小与酶的浓度无关，而与具体的底物有关，且随着温度、pH和离子强度而改变。通过测定Km的数值，可鉴别酶。可近似表示酶和底物亲合力，Km愈小，E对S的亲合力愈大，Km愈大，E对S的亲合力愈小。,.,一、抑制剂（inhibitor）的影响,使酶的必需基团或活性部位中的基团的化学性质改变而降低酶活力甚至使酶失活的物质，称为抑制剂（I）。,类型：不可逆抑制剂可逆抑制剂,竞争性抑制非竞争性抑制,6.7影响酶促反应速率的因素,.,1.不可逆抑制作用(irreversibleinhibition)抑制剂与酶的结合（共价键）是不可逆反应。不能用透析等方法除去抑制剂而恢复酶活力。,+IEI,ESH+ICH2COOHESCH2COOH+HI,.,二异丙基氟磷酸,举例：有机磷毒剂二异丙基氟磷酸。,.,2.可逆抑制作用(reversibleinhibition)抑制剂与酶的结合是可逆的。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。类型：竞争性抑制(competitiveinhibition)非竞争性抑制(non-competitiveI.）反竞争性抑制作用（uncompetitiveI.）,.,（1）竞争性抑制作用(competitiveinhibition)抑制剂和底物竞争与酶结合，妨碍了底物与酶的结合，降低了酶的活力。,ki=EI/EI,I与S结构类似，竞争酶的活性中心；有I存在时，Km随I增高而增大；E固定时，S足够大时，v=V。抑制作用可以被解除。动力学特点：Vmax不变，表观Km增大。,竞争抑制的特点,Michaelis-Menten图,.,竞争抑制的动力学特点：有I存在时，所得直线与无I时的直线在纵轴上交于一点，横轴截距负值减小，斜率增大。,Lineweaver-Burk图,.,（2）非竞争性抑制作用(non-competitiveinhibition)底物和抑制剂同时与酶结合，但形成的三元复合物EIS不能进一步转变为产物。,重金属、有机汞化合物金属络合剂（F-、CN-）、螯合剂（EDTA）,.,I与酶活性中心外的必需基团或催化基团结合，S与I之间无竞争关系；有I存在时，V随I增高而减小；S足够大时也无法使曲线与无非抑制剂曲线相重合。动力学特点：Vmax降低，Km不变。抑制程度取决于抑制剂的浓度。,非竞争抑制的特点,Michaelis-Menten图,.,有I存在时，所得直线与无I时的直线在横轴上交于一点，纵轴截距和斜率增大，随着I增大而增大。,非竞争抑制的动力学特点,Lineweaver-Burk图,.,（3）反竞争性抑制作用（uncompetitiveinhibition）抑制剂必须在酶与底物结合后才能进一步形成ESI复合物。,km,km,.,反竞争抑制的特点：,抑制剂只与酶底物复合物结合,抑制程度取决于抑制剂的浓度及底物的浓度,动力学特点：Vmax降低，表观Km降低。,.,不可逆抑制作用可逆抑制作用竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制,a,b,c,.,.,一个二肽酶对二肽Ala-Gly和二肽Leu-Gly的Km分别为2.810-4和3.510-2，哪一个二肽是酶的最适底物？该酶的两个非竞争性抑制剂的Ki值分别为5.710-2和2.610-4。哪一个是最强的抑制剂？,.,二、温度的影响,最适温度,最适温度(optimumtemperature)：酶表现出最大活力的环境温度。,温度对酶作用的两种不同影响：1.温度升高，反应速度加快；2.温度升高，热变性速度加快。,.,pH对酶作用的影响机制：1.环境过酸、过碱使酶变性失活；2.影响酶活性基团的解离；3.影响底物的解离。,pH,最适pH,v,三、pH的影响作用,最适pH（optimumpH）：表现出酶最大活力的pH值。,.,凡能提高酶活力的物质都是酶的激活剂。,四、激活剂(activator)的影响作用,类别金属离子：K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Se3+、Co2+、Fe2+阴离子：Cl-、Br-还原剂：抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽,.,6.8酶活性的调节,一、酶活性的调节方式酶量调节酶活力调节,别构调控可逆的共价修饰调节酶原激活,.,二、酶的别（变）构调控,别构调控(allostericregulation)当底物或底物以外的物质和别构酶分子上的相应部位非共价地结合后，通过酶分子构象的变化影响酶的催化活性，这种调节方式为。别构酶(allostericenzyme)有的酶可以与某些化合物（称为变构剂）发生非共价结合，引起酶分子构象的改变，对酶起到激活或抑制的作用，这类酶通常称为。别构效应物(allostericeffector)引起别构效应的物质。,.,三、可逆的共价修饰调节是一类由其它酶对其结构进行可逆共价修饰，使其处于活性和非活性的互变状态，从而调节酶活性。共价调节酶（covalentregulatoryenzyme）酶蛋白的磷酸化、乙酰化、甲基化,.,四、酶原的激活,没有活性的酶的前体称为酶原(zymogen；proenzyme)。酶原转变成有活性的酶的过程称为酶原的激活。实质：酶活性部位形成和暴露的过程。在组织细胞中，某些酶以酶原的形式存在，可保护分泌这种酶的组织细胞不被水解破坏。,.,.,6.10酶的研究方法与酶工程,酶活力指酶加速催化某一化学反应速度的能力。酶活力实质是测定酶促反应速度。酶活性测定的主要指标：酶单位酶单位（activityunit,U）在一定条件下，单位时间内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所需要的酶量。,一、酶活力的测定方法,.,国际单位(IU)在一定条件下，每分钟内转化1mol底物所需的酶量。1IU=1mol/min比活力（specificactivity）指每单位质量样品中的酶活力，即每mg蛋白质中所含的U数或每kg蛋白质中含的kat数。,表示酶的纯度,酶活力单位,.,酶活力测定方法1.反应体系中加入酶液，计时;2.灭酶活，终止反应，并记录终了时间。3.测底物减少量或产物生成量。,三氯乙酸/过氯酸/加热/SDS/破坏其辅因子,光谱分析法/化学法/放射性化学法,测酶活反应条件优化达到最适条件，所谓最适条件包括最适T、最适pH、足够大的底物浓度、适宜的离子强度及严格的反应时间，抑制剂不可有，辅