Waters四极杆质谱培训

Quattro LC/Micro 液质联用培训讲义 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 内容 仪器质量校正仪器质量校正 定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器 定量实验定量实验 维护及故障排除维护及故障排除 常用备件号常用备件号 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 仪器质量校正仪器质量校正 1. 注射泵注入校正溶液，以碘化钠铯（异丙醇/水 = 1：1, NaI 2ug/L , CsI 50ng/L）溶液为例，流速5ul/min 在质谱调机页面（MS Tune）监看四个扫描质量： 172.9 ,622.6 ,1072.2 , 1971.6 确认讯号良好及注射针内样品量充足! 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 仪器质量校正仪器质量校正 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 仪器质量校正仪器质量校正 ESI +参数设置(参数设置确保校正样品最大质谱信号响应) 50Gas Flow- Cone 350Gas Flow - Desolvation 200Desolvation Temp 100Source Temp 0.3RF lens (V) 3Extractor (V) 30Cone (V) 3.5Capillary (kV) 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 仪器质量校正仪器质量校正 LM Resolution 1（15.0）HM Resolution 1（15.0） Ion Energy 1（0.5） Entrance（50）Collision（2）Exit（50） LM Resolution 2（15.0）HM Resolution 2（15.0） Ion Energy 2（0.5） 此为第一段和第二段扫描模式参数。这是因为在进行质量 校正的时候必须同时校正两个质量分析器的三种模式（静 态扫描、动态扫描、扫描速率补偿）的缘故。 2. 在质量分析器页面（Analyzer）设定以下的数值，括 号内的数值即为设定值： 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 仪器质量校正仪器质量校正 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 仪器质量校正仪器质量校正 3. 在质谱调机页面（MS Tune）选择校正仪器以开启 的质量校正页面。 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 仪器质量校正仪器质量校正 4. 开启质量校正页面后，质量校正前请先确定目前仪器处 于未校正的状态，所有六种校正都为未校正（No Calibration），若不然则开启一个未校正（Uncal.cal） 的档案。 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 仪器质量校正仪器质量校正 5. 从下拉式选单选择适当的参考档案，如以碘化钠铯，从 下拉式选单选择适当的参考档案，如以碘化钠铯校正质 量范围两千以内可选择 Naics2 。确认后按开始键。 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 仪器质量校正仪器质量校正 6. 按开始键后会跳出自动校正选单 请勾选所有种类（Type） 处理程序部分选择讯号采集和校正 （Acquire & Calibrate），可勾选 打印报告（Print Report） 勾选完成后点压采集参数 （Acquisition Parameters） ！注意，在设定采集参数前请不要按 OK键。 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 仪器质量校正仪器质量校正 static calibration静态精确校正:使四极杆质量分析器 准确地停在指定的质荷比上 (如： Tuning， SIR ， MRM)。 scanning calibration 扫描校正:能确保所采集到的质 谱峰进行准确质量测量 (如在全扫描方式) scan speed compensation扫描速度补偿: 当仪器进 行快速扫描时，对系统进行延时补偿校正。 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 仪器质量校正仪器质量校正 7. 设定采集参数： 选择适当的校正质量范 围，校正大范围的全质 量从22校正到2000，其 余的参数可以使用预设 参数default即可，设定 完后按OK键。 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 仪器质量校正仪器质量校正 8. 按OK键后会跳出步骤6的自动校正选单，此时 按此页面OK键就会开始进行质量校正。 9. 当所有的校正都完成后，将校正的结果储存起 来，从质量校正页面的档案（File）选取另存新 档（Save As）。输入所欲储存之文件名称后按 OK即可。 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 仪器质量校正仪器质量校正 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 仪器质量校正仪器质量校正 10. 输入所欲储存之文件名称后按存盘即可，确认所 有的扫描模式都已经被校正。 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 仪器质量校正仪器质量校正 11. 根据实验要求，分别按上述步骤实验LM/HM=15， LM/HM=14，LM/HM=13三条校正曲线。 用途:根据实验需求分别调用不同分辨率的校正曲线.用途:根据实验需求分别调用不同分辨率的校正曲线. 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器 1全扫描 full scan MS1 MS2 Collision Cell Scanning (m/z M)RF only 实验要点:通过调谐仪器各项参数,不同化合物ESI/APCI的响应,毛细管电压,锥 孔电压,RF lens,离子能量,去溶剂化气温度,去溶剂化气流量,反吹气流量等参 数,找出目标化合物最佳响应参数,发挥最佳仪器检测灵敏度. 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器 样品： 利血平标样,调谐最佳实验锥孔cone voltage(CV)、毛细管电压、RF lens、离子能量等参 数，进行全扫描获最大分子离子峰609。 样品：利血平1ppm (乙腈：水=1:1配置) ESI + scan :609 (CV=45) 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器 2子离子扫描 daughter scan MS1 MS2 Collision Cell Static (m/z 609.1)Scanning Argon gasArgon gas PrecursorPrecursor ProductsProducts 利血平标样,根据全扫描获得最佳实验锥孔CV、毛细管电压、RF lens、 离子能量等参数，调谐碰撞能量collision energy (CE)、碰撞压力，进行 子离子扫描实验准备。 Daughter scan：609/195，448，397，174 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器 碰撞压力 310-3mbar 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器 3. 多反应监控MRM MS1MS2 Collision Cell Static m/z 609.1 Static m/z 195.1 Argon gasArgon gas PrecursorsPrecursors ProductProduct 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器 样品1利血平标样1ppm, 根据全扫描获得最佳实验锥孔 （CV），调谐特定碎片最佳实验碰撞能量（CE），进行 多反应监控MRM实验准备 ESI + MRM :609 /195(CV=45,CE=55) 样品2. 对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸乙酯/对羟基苯甲 酸丁酯1ppm实验，调谐最佳实验锥孔电压（CV）/碰撞 能量（CE） ESI - 对羟基苯甲酸甲酯MRM :151/136,92 CV 30/ CE 15/ CE 20 对羟基苯甲酸丙酯MRM :179/136,92 CV 30/ CE 15/ CE 20 对羟基苯甲酸丁酯MRM :193/136,92 CV 30/ CE 18/ CE 25 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器 4母离子扫描 MS1MS2 Collision Cell ScanningStatic m/z 92 Argon gasArgon gas Precursor Precursor Products Products 样品：对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯/对羟基苯甲酸丁酯实验 与氨基酸混合液。 调谐最佳实验锥孔电压（CV）/碰撞能量（CE），对羟基苯甲酸甲 酯/对羟基苯甲酸乙酯/对羟基苯甲酸丁酯三种化合物有共同碎片92， 可进行母离子扫描将其与氨基酸区别开。 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器 5. 中性丢失扫描neutral loss： MS1MS2 Collision Cell Scanning (m/z M)Scanning (m/z M-46Da) Argon gasArgon gas PrecursorPrecursor ProductsProducts 样品：混合氨基酸实验 中性丢失46(甲酸)中性丢失63(甲酸+NH3) 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器 常见17种混合氨基酸m/zM+H+ 天门冬氨酸(Asp或D)134 丝氨酸(Ser或S)106 谷氨酸(Glu或E)148 甘氨酸(Gly或G)76 *组氨酸(His或H)156 *精氨酸(Arg或R)175 苏氨酸(Thr或T)120 丙氨酸(Ala或A)90 脯氨酸(Pro或P)116 半胱氨酸(Cys或C)121 酪氨酸(Tyr或Y)182 缬氨酸(Val或V)118 蛋氨酸(Met或M)150 *赖氨酸(Lys或K)147 异亮氨酸(Ile或I)132 亮氨酸(Leu或L)132 苯丙氨酸(Phe或F)166 备注： *碱性氨基酸 易中性丢失63(甲酸+NH3) 带苯环氨基酸 仲氨酸 易中性丢失46(甲酸) 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器 6. 混合扫描 样品：对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯/对羟 基苯甲酸丁酯与氨基酸混合液。 要求：一次实验同时完成多种扫描组合方式 羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯/对羟基苯甲酸 丁酯采用母离子扫描 氨基酸采用中性丢失扫描 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器 Full scan(MS),daughter scan(MS/MS),MRM 实验参数设置建议如下： Full scan(MS) MRM(MS /MS) daughter scan(MS/MS) 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器 parent scan(MS/MS),neutral loss scan(MS/MS) 实验参数设置建议如下： parent scan(MS/MS) neutral loss scan(MS/MS) 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器 7. 其它 参数设置 Interscan delay time：一般设定为0.1s ,如果选择正负 离子同时扫描，扫描间隔要设为0.3s。 Interchannel delay time：一般设定为0.02s 。 Dwell time ：停留时间，一般设定为1s，（最少不低 于0.1s），较长的停留时间可以增加灵敏度。停留时间 设置与色谱图采集点数有关，通常要求色谱图采集点 数至少为15 个，一个色谱图出峰时间15秒计，停留时 间设定为1s, Dwell time还与实验采集的通道有关,检测 通道数目增加,要保证色谱图采集点数为15 个,需适当 减少Dwell time 时间。 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器 液相梯度：2695带11条梯度曲线，条梯度曲线，inlet method编辑 中可更改 编辑 中可更改curve，从而实现液相梯度的调整。，从而实现液相梯度的调整。 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器 11条梯度曲线表述条梯度曲线表述 12 435 6 789 10 11 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定性实验 调谐仪器定性实验 调谐仪器 从上到下，分别为curve 6，7，8变化影响分离情 况（凹形变化） 从上到下，分别为curve 6，5，4变化影响分离情 况（凸形变化） 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定量实验定量实验 对羟基苯甲酸甲酯/对羟基苯甲酸丙酯/对羟基苯甲酸丁酯定 量实验、Quanlynx数据处理、标准曲线调用、报告输出 对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸丙酯对羟基苯甲酸丁酯 分子量152分子量180分子量194 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定量实验定量实验 对羟基苯甲酸甲酯 MRM :151/136,92 CV 30/ CE 15, CE 20 对羟基苯甲酸丙酯 MRM :179/136,92 CV 30/ CE 15, CE 20 对羟基苯甲酸丁酯 MRM :193/136,92 CV 30/ CE 18, CE 25 实验内容： 样品：对羟基苯甲酸甲酯/丙酯/丁酯1ppm (甲醇：水=1：1配置) 实验甲醇：水=1：1，0.2ml/min 2.1mm*50mm*3.5um 稀释10倍，进样2/4/6/8/10/12/14ul （对于细内径短柱进样量少好） 或分别稀释10/20/30/40/50/100/200进样10ul ESI-为达到仪器最佳检测灵敏度,MRM 设置母离子/子离 子建议精确到小数后一位 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定量实验定量实验 利用Quanlynx软件Quan optimise 自动优化实验参数 找出 最佳锥孔电压cone voltage （CV）/ 碰撞能量collision energy （CE） 对羟基苯甲酸丙酯标样1ppm, 根据全扫描获得最佳实验锥孔 （CV），调谐特定碎片最佳实验碰撞能量（CE），进行多 反应监控MRM实验准备并自动完成定量实验。 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定量实验定量实验 用用 QuanLynx来编辑定量方法来编辑定量方法 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定量实验定量实验 1. 在Quanlynx界面中选择，会出现定量方法编辑界面。 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定量实验定量实验 2. 在里输入组份名称，点击，这时 组份名称会被添加到左侧的组份表里。重复第二步，将所要 使用的组份逐一添加到组份表里。 定量实验定量实验 3. 同时打开相应的色谱图，用鼠标右键选择相应的色谱峰，该 色谱峰对应的信息(质谱通道、保留时间、保留时间窗口等参 数)会自动被添加到定量方法编辑界面里. 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定量实验定量实验 4. 如果某组份是内标物，则需要在Internal Ref.里选中 该组份。 5. 注意：Concentration of Standards 项目中,各组份 一定要与样品表中的浓度表相对应. 6. 点击，编辑通用参数。 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定量实验定量实验 选择用面积还是峰高定量 输入浓度单位 选择是用内标法还是外标法选择校正曲线形式：线性 二次方 校正曲线是否过原点 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定量实验定量实验 7. 点击，编辑相关积分参数。 A. 谱图平滑参数设定 点击Smooth进入下面谱 图平滑参数设定窗口。 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定量实验定量实验 用鼠标右键选中目标峰的半峰宽，Window Size(scans)会 被自动计算出来。 选择Savitzky Golay 方式 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定量实验定量实验 B.峰积分选择这里有二组参数，1）Baselines 它用来 设定色谱峰基线位置以便进行积分，2）Peak Seperation是用来设定色谱峰的分离度参数。或者，直 接勾选Apex Track Peak Integration软件自动处理。 勾选 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定量实验定量实验 选择Threshold进行阈值设定。(根据实际情况设定) 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定量实验定量实验 9. 选择File - Save As 并输入方法名。 8. 在Concentration of Standards中，选择样品表所对应的浓 度 (CONC_A column)，如果用内标法定量时，内标物用Fixed 选项。 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定量实验定量实验 用用QuanLynx进行批处理定量分析进行批处理定量分析 1. 在样品表中，选择要进行定量分析的样品。 2. 选择 QuanLynx ，在QuanLynx软件中，选择 Process Sample。 3. 选择三项处理功能： Integrate, Calibrate, and Quantify. 4. 选择相应的定量方法。 5. QuanLynx软件就能根据所选的定量方法进行自动定 量分析，并显示出定量结果 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定量实验定量实验 浏览定量报告 （浏览定量报告 （Browse Result） 1. 在QuanLynx软件中，选择Browse Result，就可浏 览定量结果且打印报告。 2. 用QuanLynx 软件可浏览定量数据，浏览方法是选择 File Import QuanData,，选择相应的数据结果。 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定量实验定量实验 3. 点击 Display在customize the display中选择 results table, chromatogram, summary, calibration, colors和 fonts. 在 Summary area项目中选择 Summary 选择 “List by compound”就能显示所有组份的结果。 选择View- Statistics，可查看相同浓度的样品结果 选择View Totals Bar 可看到同一样品中所有组份的结 果。 4. 选择 Display - Slideshow 要显示样品的色谱图， 以及各组份的定量结果。 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定量实验定量实验 5. 修正QuanLynx定量方法和批处理方法： 选择 Edit Method，可修正定量方法，然后保存并退出。 选择 Processing Execute. 这将对样品表进行批处理，并建 立一新的校正曲线且对结果进行列表。 打印输出报告 选择 File Report Format 可改变报告输出格式 选择 File Print ，打印报告 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 定量实验定量实验 6. 输出样品信息 (包括Areas, Amounts, etc)，使用的 方法： File - Export Current Summary 输出现行样品表中所 列的各组份结果。 File - Export Complete Summary 输出样品表中每个 样品的所有组份结果。 File Export All Groups Summary输出所有样品结果 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 维护及故障排除维护及故障排除 实验要求： 15-28摄氏度 氮气99%：0.7MPa，氩气99.9%：0.10.2 MPa 通常维护包括： ESI源更换毛细管/一级、二级锥孔清洗/机械泵油更 换/液相单向阀更换/液相在线过滤器更换 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 维护及故障排除维护及故障排除 12695 面板提示面板提示lost prime 冲程冲程50ul，压力，压力25psi时会发生时会发生 一般情况一般情况wet prime 或或dry prime即可，或为单向阀脏见图 示，需清洗 即可，或为单向阀脏见图 示，需清洗/更换；更换； 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 维护及故障排除维护及故障排除 22695面板面板plunger homing over pressure 为在线 过滤芯 为在线 过滤芯inline filter堵，需取下用超声波清洗或更换。堵，需取下用超声波清洗或更换。 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 维护及故障排除维护及故障排除 通常压力波动两元流动相通常压力波动两元流动相50psi以内正常，单流动相以内正常，单流动相 20 psi以内正常，脱气真空以内正常，脱气真空0.8psi内正常。内正常。 流速与冲程关系：流速与冲程关系：0.3ml/min 冲程冲程25ul。 在软件在软件inlet method 中可编冲程。中可编冲程。 另外若另外若seal wash所用洗液流空，可在新装洗液后，所用洗液流空，可在新装洗液后， 2695面板面板diagnose中选中选seal wash自动进行，还可 配合针筒吸废液管同时进行。 自动进行，还可 配合针筒吸废液管同时进行。 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 维护及故障排除维护及故障排除 3MS连接通讯问题：连接通讯问题： 退出软件，重新进入或用退出软件，重新进入或用Peek 管轻轻接触管轻轻接触Quattro micro仪 面板右下角热启动键 仪 面板右下角热启动键 ,真空指示灯会闪一会，仪器自动进行 重新通讯连接而无须关机。但 真空指示灯会闪一会，仪器自动进行 重新通讯连接而无须关机。但Peek 管轻轻接触管轻轻接触Quattro micro仪面板右下角热启动键不可时间太长，否则真空会自 动卸掉。 仪面板右下角热启动键不可时间太长，否则真空会自 动卸掉。 2005 Waters Corporation Waters 四极杆质谱培训 维护及故障排除维护及故障排除