第2章 细胞生物学技术.ppt

第2章细胞生物学技术,2.1细胞形态结构的观察方法,2.1.1光学显微镜技术,显微镜和显微镜的分辨能力,肉眼：0.2mm;光镜：0.2m;电镜：0.2nm,:光源波长;:物镜镜口角;N:介质折射率,显微镜成像原理,普通复式光学显微镜（lightmicroscope）,双目显微镜,正置显微镜,倒置显微镜,相差显微镜（phase-contrastmicroscope）（光程差或相位差转变为振幅差，相差板）微分干涉显微镜（differential-interferencemicroscope）（厚度差转变为明暗差；增加样品反差，立体感强）,荧光显微镜（fluorescencemicroscope）,黏着斑蛋白,细胞骨架,激光共聚焦原理,激光共聚焦显微镜（laserscanningconfocalmicroscope）,黏着斑蛋白,细胞骨架（应力纤维）,共定位分析,暗视野成像原理,显微镜的暗视野功能,(A)明视野显微术；(B)相差显微术；(C)微分干涉显微术；(D)暗视野显微术,荧光漂白恢复技术（fluorescencerecoveryafterphotobleaching,FRAP）,荧光共振能量转移技术（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）,1）电镜基本知识和结构（波长小于0.1nm）2）样品制备（超薄切片，负染色，冰冻蚀刻，三维重构，扫描）3）电镜种类扫描电子显微镜透射电子显微镜扫描隧道显微镜和原子力显微镜,2.1.2电子显微镜技术,透射电镜及其图像,透射电镜照片,免疫电镜照片,扫描电镜及其图像,扫描电镜照片,冰冻蚀刻技术,冰冻蚀刻电镜技术照片,负染色电镜技术照片,2.2.1高速、超速和梯度密度离心分离各种细胞器、生物大分子及其复合物,2.2细胞组分的分析方法,差速离心,密度梯度离心,差速离心过程,2.2.2细胞内核酸、蛋白质、酶、糖类、脂类的显色,DNA：福尔根（Feulgen）反应紫红色多糖类：PAS反应黄色脂肪：苏丹III红色蛋白质：米伦（Millon）红色,2.2.3特异抗原的定性与定位,免疫荧光免疫电镜免疫沉淀Westernblotting,2.2.5特异核酸标记技术,InsituhybridizationNorthernblot(RNA);Southernblot(DNA),2.2.4放射性标记生物大分子的合成和动态,3H（DNA合成）35S（蛋白质合成）14C（碳水化合物合成）32P（核酸合成）,定性、定位、半定量研究（标记，自显影）32P（14天）,14C（5760年）,3H（12年）,35S（87天）,131I（8）,原位杂交技术,2.2.6定量细胞化学技术,2.2.7细胞内大分子的分离与分析柱层析、分子筛、免疫吸附、免疫沉淀等方法分离蛋白质组分及复合物（交联和变性）,显微分光光度术（紫外显微分光光度仪、可见光显微分光光度染色）,流式细胞仪,蛋白质电泳分析,流式细胞术,2.3细胞培养、细胞工程与显微操作技术,2.3.1细胞培养1）植物细胞（单倍体细胞培养，原生质体培养，体细胞培养）2）动物细胞（原代细胞培养，永生细胞系）3）非细胞体系（DNA复制，RNA转录，蛋白质合成，高尔基体的膜泡运输，细胞核装配等）细胞提取物，细胞核提取物,植物组织培养,动物细胞培养,细胞的克隆,2.3.2细胞工程1）细胞融合与杂交植物细胞先去壁；融合方式：仙台病毒或聚乙二醇介导，电融合等同核融合细胞，异核融合细胞，染色体丢失2）单克隆抗体技术,2.3.3显微操作技术,1975年英国科学家MilsteinandKohler,1984年获诺贝尔奖B淋巴细胞+小鼠骨髓瘤,转移细胞核、细胞器、基因等,2.3.4转基因、基因沉默、基因敲除、模式生物等,显微操作仪,显微操作示意图,MarioCapecchi(Late1980s)(UniversityofUtah)embryonicstemcellsininnercellmassastargetcells1/104cellsundergoaprocessofhomologousrecombination.,基因敲除技术,2.4细胞生物学研究的模式生物,病毒（转基因载体）细菌（大肠杆菌作为基因工程菌株）酵母（真核表达载体，基因功能分析）线虫（1000个左右细胞构成）黏菌（同步化材料）蛙（卵细胞大，易操作）果蝇（遗传背景清楚，表型易掌握）斑马鱼（胚胎发育研究的好材料）小鼠（与人更接近）,学生报告题目：1，转基因技术及其应用；2，细胞工程技术在生产实践中的应用；3，基因敲除技术及其应用；4，模式生物线虫及其在细胞生物学研究中的应用；5，模式生物斑马鱼及其在细胞生物学研究中的应用；按学号分组，按组确定题目，每个组确定一名组长并委派