食品生物技术-发酵工程

第六章发酵工程与食品工程第一节发酵工程概述第二节发酵设备与基本工艺过程第三节发酵过程控制第四节发酵工程在食品工业中的应用,第一节发酵工程概述发酵已经从过去简单的生产酒精类饮料、生产醋酸和发酵面包发展到今天成为生物工程的一个极其重要的分支，成为一个包括了微生物学、化学工程、基因工程、细胞工程、机械工程和计算机软硬件工程的一个多学科工程。现代发酵工程不但生产酒精类饮料、醋酸和面包，而且生产胰岛素、干扰素、生长激素、抗生素和疫苗等多种医疗保健药物，生产天然杀虫剂、细菌肥料和微生物除草剂等农用生产资料，在化学工业上生产氨基酸、香料、生物高分子、酶、维生素和单细胞蛋白等。,发酵工程概念,发酵工程是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。发酵工程的内容包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面。,发酵工程主要内容发酵工程是指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的技术。发酵工程由于涉及到生物催化剂，因而与化学反应有关。由于生物技术的最终目标是建立工业生产过程为社会服务，因而该生产过程可称为生物反应过程（亦称为生化反应过程）。在发酵技术中一般包括微生物细胞或动植物细胞的悬浮培养，或利用固定化酶、固定化细胞所做的反应器加工底物（即有生化催化剂参加），以及培养加工后产物大规模的分离提取等工艺。主要是在生物反应过程中提供各种所需的最适环境条件，如酸碱度、湿度、底物浓度、通气量以及保证无菌状态等研究内容。,传统发酵,最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。,生化和生理学意义的发酵,指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。,发酵：酒精发酵（酵母的第型发酵)Alcoholicferment,发酵工业,定义：是指利用生物的生命活动产生的酶，无机或有机原料进行酶加工，获得产品的工业。,适宜的微生物保证或控制微生物进行代谢的各种条件进行微生物发酵的设备精制成产品的方法的设备,获得发酵产品的条件,发酵工程的发展历史天然发酵阶段：1000多年（甚至4000多年）以前酒类的酿造；19世纪利用酵母进行大规模发酵生产。大规模生产的发酵产品有乳酸、酒精、面包酵母、柠檬酸和蛋白酶等初级代谢产物。纯培养技术的建立：19世纪中叶，发明巴斯德灭菌法，找到了乳酸杆菌的生物体。人为地控制微生物的发酵进程。20世纪初，发现某些梭菌能够引起丙酮丁醇的发酵。它是第一个进行大规模工业生产的发酵过程，也是工业生产中首次采用的大量纯培养技术。1929年Flemming爵士发现了青霉素，但无法提取精制。1942年终于正式实现了青霉素的工业化生产，这是生物工程第一次划时代的飞跃，生物技术核心的发酵技术已从昔日的以厌氧发酵为主的工艺跃入深层通风发酵为主的工艺。通气搅拌发酵技术的建立：青霉素的生产深层培养,20世纪40年代，以获取细菌的次生代谢产物抗生素为主要特征的抗生素工业成为生物发酵工业技术的支柱产业。20世纪50年代，氨基酸发酵工业又成为生物技术产业的又一个成员。实现了对微生物的的代谢进行人工调节，这又使生物技术进了一步。20世纪60年代，生物技术产业又增加了酶制剂工业这一成员。70年代，为了解决由于人口迅速增长而带来的粮食短缺问题，进行了非碳水化合物代替碳水化合物的发酵，如利用石油化工原料进行发酵生产，培养单细胞蛋白，进行污水处理，能源开发等。开拓发酵原料时期：石油发酵，醋酸生产谷氨酸。80年代以来，随着重组DNA技术的发展，可以按人类社会的需要，定向培养出有用的菌株，这为发酵工程技术引入了遗传工程的技术，使生物技术进入了一个新的阶段。基因工程阶段。,发酵工程,主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术:(1)有严格的无菌生长环境：包括发酵开始前采用高温高压对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术；在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术。(2)在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速度的计算机控制技术。(3)种子培养和生产培养的不同的工艺技术。(4)在进行任何大规模工业发酵前，必须在实验室规模的小发酵罐进行大量的实验，得到产物形成的动力学模型，并根据这个模型设计中试的发酵要求，最后从中试数据再设计更大规模生产的动力学模型。(5)由于生物反应的复杂性，在从实验室到中试，从中试到大规模生产过程中会出现许多问题，这就是发酵工程工艺放大问题。,利用微生物的特点,发酵工程所利用的微生物主要是细菌、放线菌，酵母菌和霉菌。利用微生物的特点：(1)对周围环境的温度、压强、渗透压、酸碱度等条件有极大的适应能力。(2)有极强的消化能力。(3)有极强的繁殖能力。,发酵工程的特点在研究用微生物（生物催化剂）进行某种物质生产时，大体上有两种研究方式：一种是各种酶水平上研究微生物细胞内（外）的生物化学反应，如大量摇瓶在实验室里观察限制反应速率的因素和最适的培养方法，这可以认为是一种小规模的研究形式；另一种是大规模的研究形式，即过程放大。利用小型和中型反应器（培养罐）进行培养试验，并进一步在工业规模上研究生产物的分离和精制方法，以确定在细胞水平上的综合的最适培养条件。发酵工程的一个基本特点：发酵技术的放大方面，则需要由小试放大到中试逐步进行探讨。实验室进行的小规模发酵所获得的最适条件的各种参数，能否在工业规模生产中也同样保证其最适条件，那就是不是轻而易举的事了。总结：因此如何保证大规模发酵在最适条件下进行，仍是一个值得研究的课题，它不仅涉及到发酵设备的工程问题，也与各类生物细胞的生理生化特性相关。,一般生物反应过程由四个部分组成：（1）材料的预处理培养基的制备过程，包括其配制和灭菌等；（2）生物催化剂的制备固定化技术来制备；（3）生物反应器及反应条件的选择与监控生物反应器是进行生物反应的核心设备；（4）产品的分离纯化将含量较低的产物从反应液中提取出来（指胞外产物）或从细胞中（指胞内产物）提取出来，并加以精制以达到规定的质量要求。,生物反应过程主要有这样一些特点：采用可再生资源作为主要原料，因而原料来源丰实，价格低廉，过程中废物的危害性较小，但由于原料的成分复杂，往往难以控制会给产品质量带来一定的影响；由于采用的是生物催化剂，反映过程一般在常温常压下进行。但生物催化剂易受环境的影响和杂菌的污染，因而很易失活，难以长期使用；与一般化工产品相比，其生产设备比较简单，能耗较低。但某些生物反应由于其特殊性质而使反应基质浓度和产物浓度均不能太高，这是因为微生物细胞或生物酶受底物浓度或产物浓度的抑制或不能耐高渗透压所致，不仅使反应器体积增大，而且也加大了提取的困难，因而反应器生产效率较低；尽管生物反应过程成本低，应用广，但反应极为复杂，较难检测与控制。反应液中杂质多，给分离提纯带来了困难。,生物反应过程的分类1、酶催化反应过程采用游离酶或固定化酶为催化剂时的反应过程。生物体中所进行的反应几乎都是在酶的催化下进行的。工业生产中所用的酶，或是经提取分离得到的游离酶，或是固定在多种载体上的固定化酶。2、微生物反应过程采用活细胞为催化剂时的反应过程。这既包括一般的微生物发酵反应过程，也包括固定化细胞反应过程和动植物细胞的培养过程。3、废水的生物处理过程它是利用微生物本身的分解能力和净化能力，除去废水中污染物质的过程。,Fermentationengineering,上游工程UPSTREAMPROCESSES,下游工程DOWNSTREAMPROCESSES,发酵工程组成从广义上讲，由三部分组成：上游工程、发酵工程、下游工程,UPSTREAMPROCESSES-genetics,cell-inoculumdevelopment（接种研究）mediaformulation（培养基组成）sterilization(灭菌)-Inoculation(接种),上游工程,Fermentationengineering,DOWNSTREAMPROCESSES-productextraction,purification发酵罐能承受一定的压力;发酵罐的搅拌通风装置能使气液充分混合，保证发酵液必需的溶解氧;发酵罐应具有足够的冷却面积。这是因为微生物生长代谢过程放出大量的热量必须通过冷却来调节不同发酵阶段所需的温度;发酵罐应尽量减少死角，避免藏垢积污，灭菌能彻底;搅拌器轴封应严密，尽量减少泄漏。,标准发酵罐的几何尺寸H/D=1.74d/D=1/21/3W/D=1/81/12B/D=0.81.0(s/d)2=1.52.5(s/d)3=12,2.2自吸式发酵罐自吸式发酵罐是一种不需要空气压缩机，而在搅拌过程中自吸入空气的发酵罐。应用：医药工业、酵母工业、生产葡萄糖酸钙、力复霉素、维生素C、酵母、蛋白酶等。取得了良好的成绩。,自吸式发酵罐优点：节约空气净化系统中的空气压缩机、冷却器、油水分离器、空气贮罐、总过滤器设备，减少厂房占地面积。减少工厂发酵设备投资约30左右。设备便于自动化、连续化，降低老定强度，减少劳动力。设备结构简单，溶氧效率高，操作方便。缺点：由于罐压较低，对某些产品生产容易造成染菌。,2.3气升式发酵罐气升式罐特点：结构简单，冷却面积小；无搅拌传动设备，节约动了约50，节约钢材；操作无噪音；料液可充满达8090，而不需加消泡剂；维修、操作及清洗简便，减少杂菌感染。缺点：不能代替好气量较小的发酵罐，对于粘度大的发酵液溶氧系数较低。,植物细胞培养反应器,1、悬浮培养生物反应器机械搅拌式反应器非机械搅拌式（气体搅拌式）反应器2、固定化细胞生物反应器填充床反应器流化床反应器膜反应器,动物细胞培养反应器,动物细胞培养方法：1、贴壁培养成纤维细胞和上皮细胞等贴壁依赖性细胞在培养中要贴附于壁上，迅速铺展，有丝分裂，很快进入对数生长期。2、悬浮培养在培养器中细胞自由悬浮生长的过程。主要用于非贴壁依赖性细胞培养。3、固定化培养包埋培养对两类细胞都适应，细胞生长密度高，抗剪切力和抗污染能力强。,细胞培养的操作方法1、分批式操作2、流加式操作3、半连续式操作4、连续式操作5、灌注培养动物细胞大规模培养反应器1、通气搅拌式细胞培养反应器2、气升式动物细胞培养反应器图,工业微生物菌种的扩大培养培养基灭菌空气灭菌,二、发酵基本工艺过程,发酵的流程,空气,空气净化处理,保藏菌种,斜面活化,扩大培养,种子罐,主发酵,碳源、氮源、无机盐等营养物质,灭菌,产物分离纯化,成品,工业发酵步骤和工艺流程,(1)用作培养菌种及扩大生产的发酵罐的培养基的配制；(2)培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌；(3)将已培养好的有活性的纯菌株以一定量转接到发酵罐中；(4)将接种到发酵罐中的菌株控制在最适条件下生长并形成代谢产物；(5)将产物抽提并进行精制，以得到合格的产品；(6)回收或处理发酵过程中产生的废物和废水。,菌种筛选,摇瓶试验,发酵罐试验,发酵原料的预处理,原料不同处理方法也有所差异。1.淀粉利用前需变成糊精或葡萄糖方法：酸水解（高压、耐酸）、酶水解法2.糖蜜加热杀菌和用水冲稀，也可加酸处理后再补充无机盐3.碳氢化合物：石油脱蜡一定馏分的石油经冷却脱蜡而获得的凝固点在-10的油，加入适量无机盐进行接种发酵,思考：在工业生产过程中常采用这种天然成分作为营养物质的液体培养基，这在发酵生产中有什么好处呢？,（1）液体培养基能使营养物质在发酵过程中得到充分的利用，还能为菌体提供更大的生存空间。同时，也有利于生产过程中培养条件的控制以及产物的提取。（2）采用天然物质作营养物质既能满足菌体的营养需求，又能降低生产成本，还能减少对环境的污染。,菌种斜面培养,菌种：已有的优良生产菌种和选育的新菌种方法：一般都是由保存于冷冻管及砂土管或冰箱中的斜面菌种开始，在正式使用前要先转接到新鲜斜面培养基上活化后，再用于种子扩大培养。,菌种的扩大培养,菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；生理性状稳定；菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；无杂菌污染；保持稳定的生产能力。,作为种子的准则是：,种子制备过程,实验室种子制备阶段：琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养等或液体摇瓶培养);生产车间种子制备阶段：种子罐扩大培养,种子质量的判断,由于菌种在种子罐中的培养时间较短，可供分析的参数较少，使种子的内在质量难以控制，为了保证各级种子移种前的质量，除了保证规定的培养条件外，在过程中还要定期取样测定一些参数以观察基质的代谢变化及菌丝形态是否正常。在生产中通常测定的参数为：1)pH；2)培养基灭菌后磷、糖、氨基氮的含量；3)菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观；4)其他参数，如酶活力等。,种子质量的控制措施,菌种稳定性的检查杂菌检查,培养基灭菌杂菌的危害1.使生物反应的基质或产物，因杂菌的消耗而损失，造成生产能力的下降；2.杂菌也会产生代谢产物，这就使产物的提取更加困难，造成得率降低，产品质量下降；3.有些杂菌会分解产物，使生产失败；4.杂菌大量繁殖后，会改变反应液的pH值，使反应异常；5.如果发生噬菌体污染，生产菌细胞将被裂解，使生产失败。,培养基的分批灭菌法-连续灭菌法,分批灭菌A.分批灭菌的操作分批灭菌在所用的发酵罐中进行B.分批灭菌的过程a.升温阶段b.冷却阶段c.保温阶段,连续灭菌将配制好的培养基在向发酵罐输送的同时加热、保温和冷却，进行灭菌。培养基连续灭菌过程中，蒸汽用量平稳，但蒸汽压力一般要求高于5l05Pa(表压)。其具体流程如下：,预热配制罐或预热罐中进行，使培养基的温度升到70左右；加热在加热器中，培养基与蒸汽混合，温度迅速上升到130140；保温培养基被加热到预定的灭菌温度后，进入保温设备(也称维持设备)中，经过一段时间的保温，使培养基中所含微生物全部杀灭；冷却利用喷淋冷却器、真空冷却器、板式冷却器、螺旋板冷却器、真空闪冷器等冷却没备降温。,连续灭菌与分批灭菌比较具有很多优点:高温短时灭菌,营养成分破坏少，有利于提高发酵产率;发酵罐利用率高;蒸汽负荷均衡;可节约大量能量;劳动强度小.,空气除菌,空气除菌的方法空气过滤除菌流程过滤介质的选择,空气除菌的方法,加热灭菌法辐射杀菌静电除菌介质过滤除菌法,几种较典型空气过滤除菌流程,两级冷却、加热除菌流程p264图6-9,冷热空气直接混合式空气除菌流程,高效前置过滤空气除菌流程,一次冷却和析水的空气过滤的流程,过滤介质类型,按其孔隙大小可分为两类：孔隙小于细菌和孢子当空气通过时，微生物被阻留在介质的一侧，这种介质称为绝对过滤介质。孔隙大于微生物为了达到所需的除菌效果，介质必须有一定的厚度，因此称为深层过滤介质。深层过滤介质又分成两类:a.如棉花纤维、玻璃纤维、合成纤维和颗粒状活性炭等，中间的空隙大于50m。b.将过滤材料制成纸、板或管状,发酵的中间控制,温度的控制pH值的控制泡沫的控制补料的控制发酵终点的判断,控制温度的意义与发酵热,控制温度的意义：在发酵过程中，菌的生长和产物的合成都是在各种酶的催化作用下进行的，温度是保证酶活性的重要条件，因此必须在发酵系统中保持一个稳定而合适的温度条件。发酵热的概念：发酵中的热量形式主要包括:生物热、搅拌热、蒸发热和辐射热等。而发酵热是指发酵过程中释放出来的净热量Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q辐射,温度对微生物生长及发酵的影响,温度对微生物生长的影响温度对发酵的影响最适温度的控制,温度对微生物生长的影响,在影响微生物生长繁殖的各种物理因素中，温度起着最重要的作用。,温度对微生物生长的影响表现在两方面,温度升高可增加微生物生长繁殖速度，缩短生长周期。当环境温度小于最适生长温度时，每升高10，生长速率大致增长一倍。由于温度升高，导致微生物酶变性而杀死微生物。而当温度升高到最适温度以上后，随着温度越升高生长速率下降，当温度升到一定高度时微生物死亡。,温度对发酵的影响,酶动力学温度升高，反应速率加大，生长代谢加快，生产期提前。但是因酶本身易因热而失去活性，温度越高，酶的失活也越快，表现在菌体易于老化，发酵周期缩短，影响产物的最终产量。改变发酵液的物理性质温度会影响基质和氧在发酵液中的溶氧和传递速率；菌对某些基质的分解吸收等。从而间接的影响菌的生物合成。影响生物合成方向生产四环素的金色链霉菌同时能产生金霉素,当温度低于30时,产金霉素能力较强,随着温度的提高,合成四环素的能力也提高,到达35时,则只产四环素而金霉素的合成几乎停止。,最适温度的选择和控制,最适温度是一个相对概念，就是指在该温度下最适于菌的生长和产物的合成。对于不同的菌种和培养条件以及不同的酶反应和生长阶段，最适的温度应有不同。最适温度的选择.根据生产阶段来选择。.参照其他发酵条件。.应考虑培养基的成分和浓度。,发酵中温度的控制.一般来说，接种后应当适当提高培养温度，以利于孢子的萌发或加快微生物的生长，繁殖，而且此时温度大多数是下降的。.待发酵液的温度表现为上升时，应控制在微生物的最适生长温度。.到了发酵旺盛阶段，温度的控制可比最适生长温度低些，即控制在微生物代谢产物合成的最适温度。.到发酵的后期，温度出现下降的趋势，直至发酵成熟即可放罐。,pH值的控制,pH值对菌生长和代谢产物形成的影响影响pH值变化的因素发酵过程pH值的调节及控制,pH值对菌生长和代谢产物形成的影响,pH影响酶的活性，当pH抑制菌体中某些酶活性时，会使菌体的新陈代谢受阻；pH影响微生物细胞膜所带电荷的状态，从而改变细胞膜的渗透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄，因此影响代谢的正常进行；pH影响培养基某些组分的和中间代谢产物的解离，从而影响微生物对这些物质的吸收，利用；pH不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的比例发生改变。pH影响细胞壁的结构和成分。,影响pH值变化的因素,引起发酵液中pH下降的因素有：.培养基中碳氮比例不当，碳源过多，特别是葡萄糖过量，或者中间补糖过多加之溶氧不足，致使有机酸大量积累而pH下降。.消沫油加的过多。.生理酸性物质的存在，氨被利用，pH下降。引起发酵液中pH上升的因素有：.培养基中碳氮比例不当，氮源过多，氨基氮释放，使pH上升。.生理碱性物质存在。.中间补料中氨水或尿素等的碱性物质的加入过多使pH上升。,发酵过程pH值的调节及控制,最适pH的选择初期阶段的pH值要满足微生物有较大比生长速率。在一定菌体浓度的基础上,pH值应有利于代谢产物的形成。pH的调节及控制首先要在基础培养基配方中考虑维持pH的需要，然后通过中间补料来控制pH。.添加碳酸钙法:当采用生理酸性物质作氮源时,由于NH4+被利用,余下的酸根引起pH下降,在培养基中加入碳酸钙可调节pH。.补加氨水或尿素,一方面补充氮源,另外又可调pH。.流加葡萄糖等碳源也可调pH值。.直接加酸或碱来调节。,泡沫的控制,泡沫的性质按发酵液的性质不同，泡沫一般有两种类型：一种是发酵液液面上的泡沫，气相所占的比例特别大，与液体有较明显的界面，在一些稀薄的种子液，前期发酵液中常见到。另一种是发酵液中泡沫，有称流态泡沫，此类泡沫分散很细且均匀，比较稳定，与液体之间无明显的界面，气体分散相所占的比例有下而上地逐渐增大。,泡沫的控制,发酵过程泡沫变化发酵时认为气泡有5种变化方式:.整个发酵过程中，泡沫保持恒定的水平；.发酵早期，气泡会稳定地下降，以后保持恒定；.发酵前期，泡沫稍微降低后又开始回升；.发酵开始时起泡能力低，以后上升；.以上类型的综合方式。,泡沫的控制,泡沫的产生因素.与通气，搅拌的剧烈程度有关。.泡沫的多寡与培养基的成分有关。.培养基的灭菌方法，灭菌温度和时间，也会改变培养基的性质，从而影响培养基的起泡能力。.在发酵过程中，培养液的性质随微生物的代谢活动而不断变化，因此影响泡沫的消长。泡沫对发酵的影响可增加溶氧；降低装料系数；增加菌体非均一性；增加了污染机会；导致产物损失；加消泡剂增加成本，给提取带来麻烦。,泡沫的控制,机械消泡原理:利用机械力引起强烈振动或压力变化，促使泡沫破裂;罐内消泡：1.耙式消泡桨的机械消泡；2.旋转圆板式的机械消泡；3.流体吹入式消泡；4.气体吹入管内吸引消泡；5.冲击反射板消泡；6.超声波消泡；7.碟片式消泡器的机械消泡。罐外消泡:1.旋转叶片罐外消泡；2.喷雾消泡；3.离心力消泡；4.旋风分离器消泡。,消泡剂消泡原理:1当泡沫表层存在着极性的表面活性物质而形成双电层时，可以加另一种具有相反电荷的表面活性剂，以降低泡沫机械强度,或加入某些具有强极性的物质，与发泡剂争夺液膜上的空间，并使液膜的机械强度降低，进而促使泡沫破裂。2当泡沫的液膜具有较大的表面黏度时，可加入某些分子内聚力较小的物质，以降低液膜的表面黏度,从而促使液膜上的液体流失而使泡沫破裂。常用的消泡剂:天然油脂聚醚类，高级醇和酯类，硅酮类等。,补料的内容和原则,内容：1.补充微生物碳源和能源物质2.补充菌体所需的氮源3.补加某些微生物生长或合成需要的无机盐，微量元素或前体物质4.对于产诱导酶的微生物，在补料中适当加入该酶的作用底物，有利于提高酶的产量原则：控制微生物的中间代谢，使之向着有利于产物积累的方向发展。,补料的控制,直接法:直接以限制性营养物浓度作为反馈控制参数，例如控制氮源、碳源、碳氮比等方式。间接法：是以溶氧、pH、呼吸熵、排气中二氧化碳分压