各类层析色谱分析技术完全讲解ppt课件

层析技术,1,第一节层析概述,2,层析法也称色谱法(chromatography)，是1906年俄国植物学家MichaelTswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。,一、概况,3,1941年，英国生物学家Martin和Synge首先提出了色谱塔板理论，为后来各种色谱技术的发展奠定了基础。1944年出现纸层析。以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。层析技术是一种分离技术，是混合物最有效的分离、分析方法。,4,经典色谱（offline),Tswett把植物绿叶的色素混合液加在一根装有干燥固体碳酸钙颗粒（称固定相）的玻璃长管（称为填充色谱柱）上端;洗脱剂（亦称流动相）石油醚自上而下流过；在石油醚不断冲洗下，原来在柱子上端的色素混合液向下移动。由于色素中各组分的性质的差异，最后分离成不同颜色的清晰色带；将潮湿的碳酸钙挤出玻璃管，用刀将各色带切下，对其中的组分用合适的分析方法分别进行测定。,5,6,现代色谱（online),当一个二组分（A和B）的混合样品在t1时间从柱头加入;随着流动相不断加入，洗脱作用连续进行，直至A和B组分先后流出柱子而进入检测器;从而使各组分浓度转变成电信号后记录在记录纸上，或显示在荧光屏上，或由电脑贮存后打印出来。,7,层析技术的原理,层析系统都由两个相组成：一是固定相(不动的一相)，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相(携带样品流过固定相的流动体)，即可以流动的物质，当待分离的混合物通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。,8,9,二、层析法的特点,分离效率高：复杂混合物、有机同系物、异构体、手性异构体。灵敏度高：可以检测出g.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。分析速度快：一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。应用范围广不足之处：被分离组分的定性较为困难。,10,层析应用范围,凡是溶于水和有机溶剂的分子和离子，在性质上有一定差异均可通过层析方法进行分离。分离的范围包括：无机化合物：无机盐类、无机酸类、络合物类等有机化合物：烷烃类、有机酸和有机胺类、杂环类生物大分子：核酸和核苷酸类、蛋白质、酶及肽类、多糖及寡糖类、激素类活体生物：病毒、细菌、细胞器等,11,分析的参数,常见的层析分离法分析技术，是以混合物中分离单一成分，制备一定量的产品为主，以分析鉴定化合物的性质，获得分析参数为辅。HPLC以分析为主。通过层析方法可以对物质进行一定程度的定量、定性和纯度鉴定。,12,按层析原理分类（一）,13,按层析原理分类（二）,14,离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。,吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。,凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的不同。,按层析过程的机理分类,15,按两相所处状态分类,超临界分析：利用流动相溶剂分子的气态和液态临界点的条件下进行分离，更具专一性。,16,按操作形式不同分类,层析分类法,17,纸上层析是用滤纸作为支持剂（载体）的一种色层分析法，这种方法的基本原理一般认为主要是利用混和物中各组分在流动相和固定相间的分配比的不同而使之分离。纸上层析可用于化学性质相近的混和物的分离，特别适宜于微量物质的分离和鉴别。而且使用的仪器简单，操作比较容易，重现性好。,18,三、层析前蛋白质处理,主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂蛋白分开，这些方法的特点是简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质，但分辨率低。,19,1、盐析法,盐离子与水分子作用，原来溶液中大部分的自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的作用，破坏蛋白质分子表面的水化层，暴露出来的蛋白质表面疏水性区域相互结合，形成沉淀。,20,2、等电点沉淀,在溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。,21,3、有机溶剂沉淀,降低水溶液的介电常数，增加蛋白质不同电荷之间的静电引力，使蛋白质产生沉淀；有机溶剂与水作用使蛋白质的表面水化层厚度压缩，导致蛋白质脱水，蛋白质间的疏水作用增强，从而产生沉淀。,22,四、层析基本操作过程,上样均一性洗脱装置,目的不同检测方法不同活性检测,基质均匀性柱层析的L/d比值,23,1、柱层析的L/d比值,24,2、洗脱装置,不改变溶剂体系依靠液面的水位差产生的静压力致使洗脱液不断流经层析柱缺点：随着溶液的流去，水位差也逐渐减小，流速也在变小。改善：蠕动泵或恒流泵,维持流速恒定的简易装置,25,改变溶剂系统,分级洗脱在一个溶剂系统洗涤后，改用另一溶剂系统。缺点：蛋白质和层析基质的结合强度相差并不很大，溶剂系统的改变又不可能过细过密，同一个洗脱级组分中就可能含有两种或两种以上的蛋白质，达不到分离纯化的目的。,26,改变溶剂系统,梯度洗脱一种溶液以恒定的速度连续地进入处于温和搅拌的盛有另一种溶液的容器中，经混合后的液体以同速度沉入层析柱作为洗脱液，在这样所得到的洗脱液中一种溶液的浓度以线性梯度方式连续地发生改变。注意：梯度洗脱呈现一个峰，但有可能存在两个性质接近的蛋白质。,线性梯度洗脱装置,性能未知样品的蛋白质分离：改变缓慢的梯度洗脱若为单峰：分级洗脱,27,3、结果检测,活性检测比活没有提高目的蛋白与杂蛋白并没有分开比活有所提高，但总活性回收很低目的蛋白有损失或有失活现象测定蛋白质一级结构时，可不考虑目的蛋白的生物活性,28,结果保存薄层层析速率理论:对层析分离条件的选择具有指导意义.,84,塔板理论-柱分离效能指标,塔板理论（platetheory）半经验理论：将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复（类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）。该理论将一根色谱柱当作一个精馏塔，其中的每一小段色谱柱相当于精馏塔中的一个塔板,从而描述组分在色谱柱内的分配行为。,85,把色谱柱比作精馏塔，视作由许许多多小段(塔板)组成,且塔板与塔板之间不连续;塔板之间无分子扩散。组分在每块塔板的两相间的分配平衡瞬时达到，达到一次分配平衡所需的最小柱长称为理论塔板高度H。一个组分在每块塔板上的分配系数相同。流动相以不连续的形式加入，即以一个一个的塔板体积加入，连续的色谱过程视作一个塔板中的两相平衡过程的重复。组分进入色谱柱后，在每块塔板上进行两相间的分配。塔板数越多，组分在柱内两相间达到分配平衡的次数也越多，柱效越高，分离就越好.理论塔板数为:,塔板理论假定,86,理论塔板数,由上式可知，组分的保留时间越长，峰宽度越小，则理论塔板数n越多，色谱柱效能越高。,87,有效塔板数和有效塔板高度,单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。组分在t0时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：,88,塔板理论的不足,塔板理论是模拟在一些假设条件下而提出的，假设同实际情况有差距，所以他描述的色谱分配过程的定量关系也有不准确的地方。对于塔板高度H这个抽象的物理量究竟由哪些参变量决定的？H又将怎样影响色谱峰扩张等一些实质性的较深入的问题，塔板理论却不能回答。为什么流动相线速度(U)不同，柱效率(n)不同；而有时当U值由很小一下变得很大时，则柱效能（n）指标并未变化许多，但峰宽各异，这些现象塔板理论也无能为力塔板理论忽略了组分分子在柱中塔板间的纵向扩散作用，特别当传质速率很快时，其纵向扩散作用为主导方面，这一关键问题并未阐述。塔板理论无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。,89,速率理论,1956年vanDeemter等提出了色谱过程动力学理论速率理论。他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。vanDeemter方程的数学简化式为,式中u为流动相的线速度；A，B，C为常数，分别代表涡流扩散项系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数。,90,A.涡流扩散(Eddydiffusion),A=2dpdp：固定相的平均颗粒直径：固定相的填充不均匀因子,固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，A，H，柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。对于空心毛细管，不存在涡流扩散。因此A0。,对填充柱有涡流扩散的影响,91,B.纵向扩散（longitudinaldiffusion）,B=2rDmr：弯曲因子，填充柱色谱，rVo+Vi）,115,Ve=Vo该成分的分子全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中，因而洗脱速度最快。即该成分的Kd0。ViVe-Vo该成分不被排阻而可完成进入凝胶颗粒内部,因而洗脱速度最慢。即该成分的Kd=l。Kd值介于0-l之间，物质的洗脱速度随其Kd值的增加而降低一般物质的Kd值是0KdpI，生物大分子带负电荷，解离成负离子溶液的pHpI，生物大分子带负电荷，解离成负离子溶液的pH5.2，所以当pH=5.2时，IgG带的是正电荷，不和阴离子交换树脂发生交换，上样时直接流出来了。第一个峰HAS的4.5PI5.2,所以当pH=4.5时，HAS从带负电荷变成带正电荷，从阴离子交换树脂上脱离下来第二个峰其他糖蛋白的4.0PI4.5,所以当pH=4.0时，其他糖蛋白从带负电荷变成带正电荷，从阴离子交换树脂上脱离下来第三个峰,211,用DEAE-SepharoseCL-6B柱大量分级人血浆蛋白,212,阳离子交换层析用CM纤维素分离鸡蛋清中的蛋白质组份,213,表鸡蛋清中一些蛋白质用CM纤维素分离结果的分析,214,亲和层析技术,215,亲和层析技术（AffinityChromatography,AC),定义：根据流动相中的生物大分子与固定相表面偶联的特异性配基发生亲和作用，并选择性吸附溶液中的溶质而进行分离的方法。亲和力：生物大分子与相应分子间的专一的可逆结合力。酶与底物、抑制剂、辅助因子；抗原与抗体；核酸与互补的碱基序列、核酸聚合酶、结合蛋白；激素与其受体、载体蛋白；细胞与其表面特异蛋白等。特点：根据生物大分子间的专一的可逆结合和解离的亲和力的不同进行分离；得到的产物相对纯度较高。,216,亲和层析分离原理,利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固定化的配基将只能和具有亲和力特异性吸附的生物大分子作用而使其被保留,改变淋洗液后可将其洗脱。,217,218,219,220,亲和层析的特点,待分离物质与配基专一性结合，分辨率高，操作简单，一步操作即可得到纯度较高的产品。具有浓缩作用，易于纯化含量低的物质。分离条件较为温和，能较好的保持被分离物质的活性。具有较好的物理化学稳定性能够和配体稳定的结合结构为均匀的多孔网状结构与样品中的各个组分均没有明显的非特异性吸附,221,亲和层析介质,配基：有机小分子类：苯基类、烷基类、氨基酸类生物大分子类：酶类、抑制剂、蛋白质染料：蓝色葡聚糖、荧光染料载体：纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。活化剂：最常用的有溴化氰、环氧氯丙烷、高碘酸盐等。,222,亲和层析介质的制备,配基的选择必须有适当的化学基团与活化剂的活化基团发生偶联作用，获得较高的偶联率。偶联后不会影响配基和被分离生物大分子的专一结合特性。必须能与被分离物质容易发生亲和作用，专一性强。在一定的解吸条件下，易被解吸，且保持生物大分的生物活性和理化性质。分离生物分子，应选择分子量较大的化合物作为配基，以减少空间阻碍。,223,亲和层析介质的制备,载体的选择不溶于水，具有高度亲水性。具有稀松的多孔网状结构，可提高配基的有效浓度及亲和容量。具有良好的机械性能，较好的均匀度，较强的刚性。具有足够数量的化学基团。化学惰性，非特异性吸附少。良好的物理和化学稳定性。理想的亲和层析的载体不容易得到，多数仅适用于特殊的应用，琼脂糖凝胶应用范围较广。,224,各种载体的基本性质（一）,纤维素：葡萄糖残基的链状化合物以氢键相连接的网状结构用于亲和免疫吸附、核苷酸亲和吸附。价廉、来源充足。因为它的纤维性、非专一性、非均一性，所以纯化倍数不高。葡聚糖凝胶：葡聚糖凝胶经环氧氯丙烷交联而成的产物具有良好的化学及物理稳定性。骨架上有很多羟基供配基偶联。但多孔性较差，孔径小，影响亲和层析效果。聚丙烯酰胺凝胶：丙烯酰胺单体经交联剂和催化剂聚合形成物理化学性质稳定，抗微生物侵蚀。可提供大量酰胺基与配基偶联。高浓度配基适合配基和亲和物之间亲和力较弱的系统。多孔玻璃：硼硅酸钠经高温和酸碱处理制备的有均匀孔径的玻璃。机械强度高，不怕微生物的侵蚀，可高压灭菌；表面的羟基对蛋白质具有非专一性吸附。,225,各种载体的基本性质（二）,琼脂糖凝胶：D-半乳糖和3，6-脱水-L半乳糖交替结合而成的大分子多聚糖。具有理想载体的特性，应用范围较广。交联琼脂糖：交联剂共价交联后得到的琼脂糖凝胶层析介质。采用有机溶剂进一步化学修饰、高温灭菌、盐酸胍处理时，具有更好的稳定性。活化效率和亲和容量均低于琼脂糖凝胶。聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶：丙烯酰胺和琼脂糖的共聚物兼有两者的优点。颗粒大小均匀，机械强度大，分辨率高。凝胶上的酰氨基和羟基可供活化剂活化。,226,各类基质优缺点比较,227,凝胶类载体的特点,介质上的羟基容易被多种活化剂活化且易引入不同的基团。具有大孔性和亲水性。刚性较好，对流动相阻力最小，分辨率较高。极低的非特异性吸附，对亲和吸附的特异性反应没有干扰。理化性质较稳定，可在较广的pH范围内工作，对去污剂、解离试剂保持稳定。琼脂糖凝胶不宜加热消毒、低温保存，宜湿态保存。,228,基质的活化,溴化氰活化环氧氯丙烷活化,指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。,229,活化剂的选择,溴化氰使用最多、效果最好的方法。活化效率高、活化速度快。产生剧毒的氢氰酸及溴。活化臂短，不利于生物大分子的结合。环氧氯丙烷在碱性条件下活化载体。活化效率高，活化臂较长，毒性小。活化温度较高（45-500C），活化时间较长（2h/10ml)。,230,载体偶联条件,偶联条件的选择偶联pH值：一般是在碱性条件下，活化pH13，偶联最佳pH8-10偶联缓冲液：碳酸氢钠、硼酸盐（溴化氰），高盐(0.5mol/lNaCl)偶联温度和时间：不同方法所需要的温度和时间各不相同。偶联配基的浓度：1-20mol/ml，2mol/ml最为常用。常用的偶联条件见书P94表2-4,231,偶联反应,以生物大分子为配基的偶联反应溴化氰活化载体与蛋白质配基偶联反应P95环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基偶联反应P95,232,溴化氰活化,生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨(NH2)反应，主要生成异脲衍生物缺点：非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。与配体结合不够稳定溴化氰有剧毒、易挥发，操作不便。,233,环氧氯丙烷活化,活化后的基质都含有环氧氯丙烷，可以结合含有伯氨基(NH2)、羟基(OH)和硫醇基(SH)等基团的配体,234,优点不引入电荷基团，与配体形成的NC、OC和SC键都很稳定，使用寿命长缺点与配体偶联时需要碱性条件，温度为2040，对于一些比较敏感的配体可能不适用,235,多种商品化的活化基质,236,偶联反应,活化载体“接臂”：小分子配基与被分离的大分子之间存在空间阻碍，使亲和吸附无效。因而采取在载体与配基之间连接一段适当长度的有机小分子（“手臂”），从而增加配基的活动度和与被分离物的接触。短臂：P95长臂：P95封闭：封闭未被配基偶联的少部分活化基团。封闭方法：弱碱性pH下过夜、Tris-HCl缓冲液（pH8.0）中水解2小时、加入过量的小分子伯氨基试剂（乙醇胺、葡萄糖胺、甘氨酸、谷氨酸、甘露糖）。,237,配体,与待分离的物质有适当的亲和力与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性与基质稳定的共价结合自身应具有较好的稳定性,238,配体的分类,特异性配体只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体eg.抗原和抗体、酶和它的抑制剂通用性配体特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体eg.凝集素可以结合各种糖蛋白,239,蛋白质亲和层析中的合适配体,240,亲和介质的技术指标,配基偶联量：以每克或每毫升载体偶联配基的微摩尔数表示，适合于相对小分子量配基的表示。样品吸附量：以每克或每毫升载体吸附样品的毫克数表示，适合于大分子量配基的表示。化学稳定性：抗氧化物，配基不降解。耐酸碱性：在较广的pH范围(pH3-10)稳定。,241,亲和层析技术,亲和层析介质,预处理,装柱,平衡,上样,洗去未吸附杂质,洗脱,收集洗脱峰,亲和吸附剂的再生,实验流程,242,243,吸附条件的选择,选择合适大小层析柱：根据亲和吸附剂的吸附容量和待分离物质的总量。亲和层析柱填装及样品溶液上样。吸附条件的选择：合适的缓冲液组成、pH值、离子强度、上样体积、温度、流速。样品溶液的pH值和离子强度要与平衡缓冲液一致样品中杂质多，纯化对象与配基间结合力弱时，可以降低流速或反复上样黏度大或有细小颗粒的样品溶液容易堵塞柱子，可以采用搅拌吸附的方法上样后，可用平衡缓冲液冲洗层析柱以除去未吸附的杂蛋白。,244,上样,层析柱较短，通常10cm左右样品液的浓度不宜过高上样时流速比较慢样品缓冲液中有一定的的离子强度上样时选择适当较低的温度,245,洗脱,特异性洗脱指利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。非特异性洗脱指通过改变洗脱缓冲液pH、离子强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。,246,特异性洗脱,247,优点：特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。可避免蛋白质变性缺点：较长的时间、较大的洗脱条件。改善方法：选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度,特异性洗脱,248,非特异性洗脱,与配体亲和力较小连续大体积平衡缓冲液冲洗，不影响活性，但洗脱体积较大，待分离物质浓度较低。配体结合较强时适当的pH、离子强度洗脱，注意尽量不影响待分离物质的活性与配体结合非常牢固时使用较强的酸、碱或在洗脱液中加入脲、胍等变性剂，使蛋白质等待分离物质变性，洗脱后再复性,249,洗脱条件洗脱剂的选择,洗脱剂不引起被分离物质的变性失活。凡是可削弱分离对象与配基间的作用力如静电吸引力、疏水作用力和氢键等的试剂都可做为洗脱剂。采用改变pH、离子强度或缓冲液组成的方法，降低固定化配基和生物大分子之间的亲和力。洗脱剂种类：竞争性洗脱：在洗脱液中加入与亲和吸附剂上相同或不同的配基。离子强度洗脱：减弱配基与被分离物质的亲和力，有利于洗脱。pH+离子强度洗脱：适合于结合得比较牢的物质。变性剂洗脱：有的蛋白质在一定浓度的变性剂中有较好的稳定性。化学断裂：采用专一的化学方法将配基和载体之间的连接键断裂，得到配基-蛋白质复合物。,250,洗脱条件洗脱方式的选择,一步洗脱：属于非选择性洗脱方式，应用于高度特异性吸附剂的结合，一次洗脱可将被吸附的物质全部洗脱下来。分步洗脱：属于选择性洗脱方法，用几种不同的洗脱条件分步洗脱，将亲和力大小不同的组分分开。梯度洗脱：属于选择性洗脱方法，利用洗脱液的浓度梯度变化，将不同的被吸附物质洗脱下来，比分步洗脱更有可能得到较纯的分离对象。,251,亲和层析介质的再生与保存,随着使用的次数增加，亲和效率会下降。往往亲和吸附剂的一些物理性状也发生了明显的变化，如吸附剂结团、颜色改变等。在亲和吸附剂上发生了不可逆的吸附，有变性蛋白的积累。再生：用大量的洗脱液或较高浓度的盐溶液洗涤，再用平衡液重新平衡严重的不可逆吸附时，使用高浓度的盐溶液、尿素等蛋白变性剂或加入适当的非专一性蛋白酶保存：溶胀状态，温度4-80C，20%乙醇溶液。加入0.01%的叠氮化钠，4C下保存,252,影响亲和层析的主要因素,样液体积的影响：吸附能力强的物质，上样体积要求不严格（根据柱子的容量）；吸附能力弱的物质，上样量不超过介质的最大吸附量的5%，而且浓度要高。低浓度的样品可以反复上样。高浓度样品上样前，需要稀释。流速的影响：上样、洗脱流速应较慢。发生亲和吸附时配基与生物大分子之间达到结合反应平衡是一个缓慢的过程。上样的流速应尽量地慢，保证被结合物与配基之间有足够的时间达到吸附平衡。洗脱时，结合物的最初解离限制了洗脱速度。,253,影响亲和层析的主要因素,柱长的影响：根据亲和介质的吸附容量和待纯化样品的总量确定柱子的大小。介质吸附容量高，选择短柱子，较慢流速；介质亲和力低，选择长柱子。温度的影响：亲和介质的吸附强度随温度升高而减小，一般采用40C吸附，250C洗脱（不影响活性的条件下）。,254,亲和层析用于蛋白质分离的实例,免疫亲和层析凝集素和糖蛋白亲和层析含有辅酶的酶类的亲和层析酶和蛋白类型抑制剂的亲和层析肝素为配体的亲和层析染料配体亲和层析金属螯合层析,255,1、免疫亲和层析,小鼠血清不同亚型IgG的分离,256,257,2、凝集素和糖蛋白的亲和层析分离,凝集素是在自然界广泛存在的一大类糖结合蛋白。它们具有不同的糖结合专一性。利用天然存在的一些多糖和被固定化的不同糖链结构的糖蛋白，可以有效地分离纯化不同型的凝集素，也可应用固定化的凝集素分离纯化各种糖蛋白。,258,.用含有半乳糖的天然多糖-琼脂糖的交联产物分离天花粉凝集素,259,260,.糖蛋白亲和层析,不同的糖蛋白具有不同的单相组分和糖链结构，它们和不同的凝集素呈现出不同的结合能力。常用的凝集素：ConA、LCA对甘露糖专一WGA对N-乙酰氨基葡萄糖专一,261,人血色素结合蛋白(hemopexin)的分离,回收率达91,262,猪淋巴细胞质膜糖蛋白的分离,1的脱氧胆酸钠增溶膜蛋白,上固定化的LCA柱(1cm8cm),用1的脱氧胆酸钠洗涤亲和柱，除去杂蛋白,用含2-甲基甘露糖苷的1的脱氧胆酸钠洗脱膜糖蛋白,263,3、含有辅酶的酶类的亲和层析,很多的酶中都含有不同类型的辅酶，最为常见的是氧化还原酶和脱氢酶含有NAD。为此用固定化的NAD可以分离不同类型的氧还酶和脱氢酶，或激酶,固定化NAD柱,264,4、酶和蛋白类型抑制剂的亲和层析,一些酶及其抑制剂间存在着非常专一的相互作用。一些酶的抑制剂被固定化以后，就可用于一些酶的分离纯化。一些固定化的酶也被应用于蛋白类型的抑制剂的分离。为了避免位阻现象，在酶类的小分子抑制剂固定化时，常要插入一些不同长度的“手臂”，如插入8-9个原子,265,胰蛋白酶抑制剂的分离纯化,部分纯化的牛卵巢胰蛋白酶抑制剂溶于2mlpH4.0的乙酸缓冲液,流经用同一缓冲液平衡的固定化胰蛋白酶柱,平衡液可洗去杂蛋白,用0.1molL的HCl，pH约1.2的溶液(内含0.5molLNaCl和10mmol/LCaCl2)洗脱胰蛋白酶抑制剂,266,大肠杆菌EcoPl的分离,267,5、肝素为配体的亲和层析,肝素是蛋白聚糖中的一种，可以和许多类型的蛋白质结合。,268,6、染料配体的层析,染料树脂不专一的亲和介质优点稳定、和许多类型的酶结合，但又不被酶所作用、价格低廉eg.Cibacron蓝F3GA,269,碱性磷酸单酯酶的分离,回收率62,回收率96,270,金属螯合层析,271,金属螯合层析（metalchelatingchromatography,MCC）,概念：利用固定相偶联的配基亚胺基乙二酸钠与二价金属离子发生螯合作用，该金属离子又与蛋白质分子中的某些含有巯基或咪唑基的氨基酸结合，利用这种特性进行层析分离的方法。应用：分离蛋白质(含有组氨酸、半胱氨酸、咪唑基等）分离金属结合蛋白和非金属结合蛋白特点：有一定的专一性；分离特异性比IEX好，比AC差；应用比AC广，比IEX窄。,272,金属螯合层析分离原理,金属螯合层析介质上偶联的配基（亚氨基二乙酸钠）与金属离子发生可逆性螯合吸附（偏碱性条件）。二价金属离子与流动相中的半胱氨酸、组氨酸、咪唑等发生可逆性螯合吸附。金属离子是桥梁，结合方式都是可逆的。洗脱可以在不同部位进行EDTA：金属离子与螯合介质的结合部位咪唑：金属离子与被分离分子的结合部位,273,金属螯合层析,基于蛋白质的组氨酸咪唑基和半胱氨酸巯基能与铜、锌、镍离子间形成稳定的螯合物而进行分离的。,三阶段,274,金属螯合层析介质,介质的分类以琼脂糖珠为载体,以亚胺基二乙酸钠为配基,通过活化偶联而成。P117表2-10二价金属离子Cu2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+、Cd2+、Co2+以金属盐的形式存在。,275,螯合层析介质的制备,载体：琼脂糖凝胶活化剂：1,4-双-2,3环氧丙氧基-丁烷螯合剂：二价金属离子盐溶液活化偶联再生,276,分离条件的选择,缓冲液pH的选择平衡缓冲液pH选择：在偏碱性环境中，有利于二价金属离子与螯合层析介质和被分离物质发生螯合，利于分离，通常选择偏碱性缓冲液有些二价金属离子在碱性条件下会出现絮状沉淀，则选择中性缓冲溶液洗脱缓冲液的pH选择：酸性条件下，二价金属离子不易与相关基团发生螯合作用选用偏酸性缓冲液（醋酸、柠檬酸）,277,分离条件的选择,离子强度的选择：根据分离模式进行选择正相螯合层析低离子强度的缓冲液上样，高离子强度的缓冲液洗脱分离亲水性较强的蛋白质和肽类反相螯合层析高离子强度的缓冲液上样，低离子强度的缓冲液洗脱疏水性较强的蛋白质和肽类,278,分离条件的选择