植物生理学实验课件植物衰老生理2018秋冬

植物衰老生理1,植物组织中可溶性蛋白的测定,Developmentalsignals,Environmentalsignals,Disassemblyofcellularcontentsanddegradationofmacromolecules,Celldeath,Decreaseinphotosynthesis,activationofsenescenceprogram,实验原理,衰老是指细胞、器官或整个植株生理功能衰退，最终自然死亡的过程。,衰老时的生理生化变化蛋白质显著下降,核酸含量的变化,光合速率下降,呼吸速率下降,生物膜结构变化,植物内源激素的变化等。,实验原理,植物叶片衰老过程中，叶绿素含量下降，叶色变黄，蛋白质含量减少（可溶性蛋白）。自由基代谢失调,并在体内积累膜脂过氧化的产物之一：MDA,可溶性蛋白测定的原理,考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后，溶液的吸收光谱发生变化，从465nm偏转到595nm，并表现出在595nm处的吸收值与溶液中的蛋白质含量有线性关系，其范围从01000g/ml。据此可制作蛋白质的标准曲线，牛血清蛋白为常用的标准蛋白。待测样品经缓冲液提取后，可溶性蛋白溶于上清液中，蛋白质提取液与考马斯亮蓝G-250反应呈蓝色。测定595nm吸收值，并根据蛋白质的标准曲线，得到样品中可溶性蛋白的含量。,实验步骤,制备蛋白提取液称叶龄差异明显的叶片各0.50g，加入5.00ml磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以10000g离心力作用下（4C）离心10min，其上清液即为蛋白提取液。注意：2人1组离心前平衡,蛋白标准曲线的制作,蛋白质标准溶液的配制：称取牛血清蛋白（电泳纯）溶于0.15MNaCl溶液中，制成1mg/ml的母液，再用磷酸缓冲液配成各含0、40、80、120、160g/200ul牛血清蛋白的标准溶液。考马斯亮蓝G-250蛋白染色试剂的配制,0100g/ml蛋白标准曲线的制作,准确吸取0.2ml各含0、40、80、120、160g牛血清蛋白的标准溶液，分别放入10ml的试管中，加入4.8ml考马斯亮蓝G-250蛋白染色试剂，混合后放置2min，用10mm厚的比色杯在595nm下比色读取OD值，制作通过原点的直线即为其标准曲线。,显色反应,样品的测定：取40l蛋白提取液+160l磷酸缓冲液于玻璃试管中，加入4.8ml考马斯亮蓝溶液，混匀后放置2min，用10mm厚的比色杯在595nm下比色读取OD值。对照为空白的磷酸缓冲液加上4.8ml考马斯亮蓝溶液。,可溶性蛋白质含量的计算,可溶性蛋白含量(g/g.FW)=标准曲线上查得的蛋白质量（g）提取液体积/（测定加样量*鲜重）,植物衰老生理2,植物组织中丙二醛的测定,MDA测定,MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成三甲基复合物，该复合物最大吸收峰在532nm处；最小吸收峰600nm处消光系数为155(mM)-1cm-1,MDA的测定,取上清液1.0ml于7ml离心管中,加TBA与TCA混合液4.0ml，然后在离心管盖上戳一小孔，92C水浴保温30min空白管：1mLPi-buffer+TBA与TCA混合液4.0ml（92C水浴30min）冷却后，平衡，离心5min;5000rpm测定A532,A450和A600,MDA含量计算公式,L为比色杯厚度(cm),蔗糖对MBA-TBA反应有干扰，可用下式消除：MDA(M)=6.45(A532-A600)-0.56A450Equ.2,进一步求出单位鲜重植物组织中的MDA含量,第二次离心的目的何在？植物组织中那些物质对丙二醛测定（TBA法）干扰较大？研磨、离心时为何可以不用冰浴和低温？,植物组织中超氧物岐化酶（SOD)活性测定,高等植物叶片中SOD活性随衰老而下降。,测定原理,四氮唑蓝(NBT)光照还原的分光光度法：核黄素受光照产生的O2.-能将NBT还原为蓝色的甲腙，甲腙在560nm波长有最大吸收,而SOD能清除O2.-,抑制甲腙的产生使吸收减小。通过分光光度检测SOD对O2.-的抑制率,可以表征出SOD含量。（但是,在水性条件下NBT还原法得到的甲腙是蓝色混悬液,做长时程分析时沉淀表现尤为突出,属分光光度法检测的极端条件,使得该法实验数据重现性差;同时,在560nm波长对此法产生的甲腙进行检测,即使加入过量的SOD,也无法获得100%的对O2.-抑制率.为此,人们在增加甲腙水溶性方面做了许多改良,如添加Met、SDS、BSA助溶以及采用水溶性更好的四唑类替代物等。）,试剂,NBT反应液含50mMPi-buffer(pH7.8),13mM甲硫氨酸，63MNBT,1.3M核黄素和0.1mMEDTA。,步骤,称叶龄差异明显的叶片各0.50g，加入5ml磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8），于冰浴中研磨提取，将匀浆液转入1.5mL离心管，用电子天平平衡后以10000g离心力作用下（4C）离心10min，其上清液即为酶提取液。,90,取四只试管，分别在暗光条件下加入4mLNBT反应液，其中两只加100LPi-buffer，另两只加100L酶粗提液,摇匀。加Pi-buffer的一只放在暗处作空白。其余三只在25照光（4000-10000lux