课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.pptx

【课本21页研究思路（一）】水生耐热细菌Taq于1996年在美国黄石国家公园中的一个热泉被发现并筛选出来的，Taq菌中分离的各种酶，它们耐受的温度都很高。其中TaqDNA聚合酶被广泛运用于PCR技术。,在寻找目的菌株时，要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找；,在实验室筛选菌株时，可以人为提供一个有利于目的菌株生长，且不利于其他菌株生长的条件。,生物与环境具有相互依存的关系,将滤纸埋在土壤中，是人工设置一个纤维素分解菌生存的适宜环境，使纤维素分解菌相对聚集。一般我们将其埋于深约10cm左右的腐殖土壤中。,【课本28页资料一】,微生物的计数,实验流程,培养基的配置,按照培养基的用途分类：,1.基础培养基：含有一般微生物生长繁殖所需基本营养物质的培养基，eg牛肉膏蛋白胨固体培养基（细菌的基础培养基）,2.加富培养基：用于培养要求比较苛刻的微生物，在基础培养基中加入血清、动植物组织提取液等制成的培养基。,微生物的计数,实验流程,培养基的配置,按照培养基的用途分类：,3.选择培养基：根据菌株的特点，人为提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或者阻止其他微生物生长，来达到筛选的目的的培养基。,4.鉴别培养基：是一类在成分中加入能与目的菌株的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只需用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找到目的菌落的一类培养基。,微生物的计数,实验流程,培养基的配置,1、分解尿素的细菌,【相关信息】尿素CO(NH2)2是一种重要的农业氮肥。但是尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，反应如下：,氮源,配制以尿素作为唯一氮源的培养基,微生物的计数,实验流程,培养基的配置,1、分解尿素的细菌,配制以尿素作为唯一氮源的培养基,出现的结果：能够合成脲酶的微生物以尿素为氮源进行生长繁殖；,不能合成脲酶的微生物因缺乏氮源，生长受到抑制。,微生物的计数,实验流程,培养基的配置,1、分解尿素的细菌,选择培养基,可以在此培养基上生长的微生物有：尿素分解菌以N2为氮源的固氮菌以NH3为氮源的微生物,微生物的计数,实验流程,培养基的配置,（1）在以尿素为唯一氮源的培养基上加入酚红指示剂,原理：脲酶催化尿素分解成氨培养基碱性增强酚红变红脲酶阳性,如何进一步鉴定目的菌株并排除培养基上其他生存的微生物对实验结果的影响？,1、分解尿素的细菌,微生物的计数,实验流程,培养基的配置,1、分解尿素的细菌,如何进一步鉴定目的菌株并排除培养基上其他生存的微生物对实验结果的影响？,可以在选择培养基上生长的微生物有：尿素分解菌以N2为氮源的固氮菌以NH3为氮源的微生物,鉴别培养基原理：脲酶催化尿素分解成氨培养基碱性增强酚红变红脲酶阳性,微生物的计数,实验流程,培养基的配置,1、分解尿素的细菌,如何进一步鉴定目的菌株并排除培养基上其他生存的微生物对实验结果的影响？,（2）设置对照排除固氮菌对实验结果的影响。,微生物的计数,实验流程,培养基的配置,.选择培养,.稀释涂布,.土壤取样,.培养观察,对照组1个平板、实验组3个平板，符合了对照原则和重复原则。,从肥沃、湿润的土壤中取样，取样时要注意先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,尿素作为培养基的氮源。,细菌的最适培养温度为3037，培养12天。,.鉴别培养,以尿素为氮源的培养基中加入酚红指示剂。,微生物的计数,实验流程,培养基的配置,2、分解纤维素的微生物,【相关信息】地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%-60%能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为他们能够产生纤维素酶。纤维素酶是一种复合酶，包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，葡萄糖先被C1酶和CX酶分解成纤维二糖，继而被葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。,微生物的计数,实验流程,培养基的配置,液体培养基，因为没有琼脂存在。液体选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物被富集和浓缩。,Q：旁栏给出的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么要利用这种培养基？,配制以纤维素作为唯一碳源的培养基,微生物的计数,实验流程,培养基的配置,Q3：你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？,Q2：这个培养基是如何对微生物进行选择的？,仅存在纤维素粉一个碳源，所以就能够起到筛选作用。,取土壤浸出液于基础培养基（不以纤维素作为碳源）中培养，并与经过选择培养的浸出液进行菌落数目对比。,选择培养基：一般我们会根据菌株的特点，人为提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或者阻止其他微生物生长，来达到筛选的目的。,选择培养基以纤维素为唯一碳源,微生物的计数,实验流程,培养基的配置,2、分解纤维素的微生物,在选择培养基上生长的就是纤维素分解菌吗？,可以在选择培养基上生长的微生物有：纤维素分解菌以CO2为碳源的微生物以葡萄糖为碳源的微生物,微生物的计数,实验流程,培养基的配置,【鉴别原理】,刚果红（CR）染色法：,刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与纤维素的水解产物发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红-纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，这样我们就可以通过是否产生透明圈来鉴定纤维素分解菌。,微生物的计数,实验流程,培养基的配置,【刚果红染色的两种方式】,方式一,方式二,缺点:操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂。,优点:显示出的透明圈基本上是纤维素分解菌的作用；,优点:操作简便，不存在杂菌混杂；,缺点:,所显示出的透明圈不一定是纤维素分解菌的作用。,产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应,部分微生物有降解色素的作用,微生物的计数,实验流程,培养基的配置,.稀释涂布,.选择培养,.土壤取样,.鉴别培养,刚果红染色法，两种染色方式，有各自的优缺点。,.挑选菌落,透明圈的产生表明该处有利用纤维素的纤维素分解菌：透明圈大，分解利用纤维素的能力越强。,培养基的配置,微生物的计数,实验流程,（一）显微镜直接计数法,1、原理：将少量待测样品的悬浮液置于血球计数板上，于显微镜下直接计数的一种简单、快速、直观的方法。,2、计算方法,微生物数/ml=（80小格内微生物数/80）*400*10000*稀释倍数,培养基的配置,微生物的计数,实验流程,（一）显微镜直接计数法,3、优缺点,优点:计数方便、操作简单。,缺点:,不能区分死菌、活菌。不适于对运动细菌的计数。个体小的细菌在显微镜下是难以观察的。,培养基的配置,微生物的计数,实验流程,（二）菌落计数法（间接计数法）,1、计算公式,每毫升样品中的菌株数=（C/V）*M,C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL）M代表稀释倍数,原理：一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌,培养基的配置,微生物的计数,实验流程,2、优缺点,优点:计数的都是活菌。,缺点:,统计出来的菌落数比实际的活菌数少。,人为计数误差。,操作时存在杂菌污染。,（二）菌落计数法（间接计数法）,培养基的配置,微生物的计数,实验流程,3、优化操作（样品稀释及实验原则）,【样品的稀释】,由于土壤中各类微生物数目不同，所以一般在分离不同微生物时我们会采用不同的稀释范围。,细菌：104、105、106放线菌：103、104、105真菌：102、103、104,（二）菌落计数法（间接计数法）,培养基的配置,微生物的计数,实验流程,3、优化操作（样品稀释及实验原则）,【重复实验】,（二）菌落计数法（间接计数法）,在实验过程中为了避免实验误差，让实验的结果更加准确，我们要设置3个或3个以上的重复实验。,培养基的配置,微生物的计数,实验流程,3、优化操作（样品稀释及实验原则）,【设置对照】,（二）菌落计数法（间接计数法）,Q1：现在请大家尝试设计对照实验证明是否是培养基污染影响实验结果？,A同学的培养基不加土样培养（空白对照组）,无菌落,有菌落,培养基没有污染,培养基污染,培养基的配置,微生物的计数,实验流程,3、优化操作（样品稀释及实验原则）,【设置对照】,（二）菌落计数法（间接计数法）,Q2：设计对照实验证明由于土样不同还是由于A同学操作失误而影响实验结果？,其他同学取与A同学相同的土样进行实验（实验组）,约150个菌落,约50个菌落,土样不同,A同学操作有问题,A同学的实验结果约15