重组制品生产用哺乳动物细胞质量控制技术评价一般原则解析

用于生产重组产品的哺乳动物细胞质量管理技术评价的一般原则双oo 6年10月列表1前言1.1目的和意义1.2服务范围1.3限制2宿主细胞选择2.1宿主细胞的起源、历史和一般特征2.1.1宿主细胞的起源和历史2.1.2宿主细胞的一般特性3重组工程细胞克隆工艺、筛选和鉴定3.1目的基因来源3.2表达载体的特定构建阶段3.3宿主细胞导入方法和重组工程细胞筛选3.4重组工程细胞的初步鉴定4建立重组工程细胞库4.1建立细胞库4.2建库细胞管理验证5芯库5.1细胞识别5.1.1细胞瘤的鉴定5.1.2肿瘤形成试验5.1.3目的基因和表达框架分析5.1.4表达产品检测5.2微生物污染检测5.2.1细菌、真菌和支原体检测5.2.2病毒因素检查5.2.2.1体外试验5.2.2.2体内试验5.2.2.3种类特定病毒验证5.2.2.4逆转录病毒检测5.2.2.4.1感染性试验5.2.2.4.2反转录酶检测5.2.2.4.3透射电镜检查6细胞稳定性研究6.1存储条件下的稳定性6.2代/扩增过程中的稳定性6.2.1基因水平比较6.2.2目的产品的表达水平比较6.2.3细胞本身的稳定性6.2.4内源性因素检查6.2.5肿瘤发生监测7生产过程细胞质量控制7.1一般生产过程监控7.2细胞增殖限制7.3控制其他风险因素摘要89，名词说明十、参考文献1前言具有复杂结构的抗体、凝血因子、酶、激素等生物大分子，通常要利用哺乳动物细胞，用具有预定生物活性的重组物质准确地表达和修改。随着生物工程技术的发展和进步，现在这些细胞的应用不断增加。在宿主细胞选择、重组工程细胞构建和生产细胞培养扩增和监测过程中，不仅对细胞的适合性、目的产物表达能力，还对细胞培养产生的内源性病毒、宿主细胞残留蛋白质和DNA、肿瘤成分等潜在危险因素对重组产品的安全影响进行了初步研究阶段，对库细胞、培养过程细胞生产、最终细胞生产的综合验证和控制，对病毒和/或肿瘤形成成分的去除/停用过程进行了验证。1.1目的和意义完全检测出的种子细胞是实现再生种子细胞具有共同始祖细胞的重组基因工程产品生产的前提和基础，保持相同的遗传和生物学特性，持续稳定在特定培养环境和条件下携带的外来目的基因。只有通过在扩增培养及生产过程中查明细胞变化的研究，才能有效地控制危险因素，满足生产的持续要求，保持产品质量的一致性。本技术评价的一般原则是阐述用于生产重组产品的哺乳动物细胞质量管理的基本内容和相关要求，重点研究全面完整的细胞质量测试，验证生产细胞培养过程，构建系统规格重组工程细胞库，引导生产过程细胞质量的有效监控。1.2服务范围本技术评价的一般原则仅适用于生产上述抗体等治疗用重组产品的哺乳动物细胞，不包括细菌或酵母等重组工程菌，还包括治疗用体细胞、疫苗生产用细胞基质、杂交瘤细胞等。相关内容可参考国家制定的指导原则及药品审查中心公布的药品技术评价的一般原则。用于生产重组产品的哺乳动物细胞也必须满足这些现有文件的要求。1.3限制本技术评价的一般原则是，目前重组工程细胞结构、功能、细胞肿瘤性及内源性病毒对重组产品的危害和微生物污染因子的危害性的共识，同时，提出了技术探讨中重点关注的问题和基本原则，应结合具体细胞和实际培养控制条件进行考虑和选择。2宿主细胞选择要综合分析来源、背景非常明确的合适宿主细胞、存在的内源性病毒和/或肿瘤性等影响产品安全性的因素，以及产品的纯化程度、细胞培养和生产过程中危险成分的去除/停用能力、残留物调节水平、临床应用适应症和用法等特征，权衡利弊，决定适合特定产品的宿主细胞。如果可能的话，选择显示肿瘤检查阴性和低增殖代数值的宿主细胞。改进的继代细胞，新构建的转基因细胞，甚至肿瘤细胞，预先研究、背景资料、肿瘤形成危险等方面的知识非常有限，因此开发和应用需要引入新的安全风险，慎重权衡利弊，进行充分的研究，严格控制潜在危险。2.1宿主细胞的起源、历史和一般特征必须明确用于制造重组工程细胞的宿主细胞的起源和培养历史。例如，分离最初建立干细胞/系统的器官，在不同的器官内引入，通过传代后进行的检查分析项目和确认研究结果，细胞保存状态，体外培养过程中使用的人类或动物衍生物质等。2.1.1宿主细胞的起源和历史应提供有关宿主细胞源的相关资料和证明文件，说明遗传操作是否引入过外源基因序列，如细胞确认、内源性及外源因子检查、导入时进行的审查检查结果等。2.1.2宿主细胞的一般特性需要说明宿主细胞的基本特征，如形态、培养和生长的一般特征、培养条件及培养液要求。新构建的细胞株应检测肿瘤发生特点。3重组工程细胞克隆工艺、筛选和鉴定目前，可以用多种表达载体、宿主细胞、基因导入方法、筛选标记等构建、审查工程细胞，构建成功的标志是工程细胞正确有效地表达结构性生物活性的目的和产物。如果可能的话，提供重组工程细胞的构建和识别的详细信息，应着重于以下几点：3.1目的基因来源应包括早期获得目标基因序列的来源和背景信息、目标基因cDNA制备方法和必要的初步序列分析。3.2表达载体的特定构建阶段应该说明基因插入和侧区序列、复制因子、启动子、加强子、电阻标记、主要酶切部位等表达载体的组成部分和主要组成部分的起源和功能。需要详细说明表达向量的制作或改造过程。要进行成功的表达载体制作所需的识别，并提供制作所用部位的酶图谱等相关测试资料。3.3宿主细胞导入方法和重组工程细胞筛选应详细说明载体引入宿主细胞的方法和手术过程、重组工程细胞的筛选原理、条件和标准，以及增加基因副本数量的方法等。说明在宿主细胞中引入外源基因后出现的变化，符合筛选标准的候选细胞可以是多细胞株，但要用于建立的细胞株必须是研究比较后确定的单细胞克隆。3.4重组工程细胞的初步鉴定应检测重组细胞的基本特性变化，并比较研究插入外源基因后细胞的肿瘤形成特性变化。在宿主细胞内，必须说明表达载体的状态(是否合并到染色体中)，并使用适当的方法确定其份数。阐述了目标基因在宿主细胞内表达的启动和调节方法，进行了初步表达产物的鉴定和表达水平检测。选定的工程细胞株必须充分确认目标基因的全序列，以确保用于编码和表达目的产物的基因早期核酸序列的准确性。4建立重组工程细胞库由连续传代细胞生产重组产品的最大优点是，使每个产品部署都有经过验证的共同起源细胞，因此，建立细胞库的目的是确保生产可持续性和产品质量的稳定性。重组产品的生产必须以良好的细胞库管理为基础。4.1建立细胞库细胞库可以是三个阶段：原始细胞库、主细胞库(MCB)和工作单元库(WCB)。也可以使用由初级细胞库和工作细胞库组成的次级细胞库。在某些情况下，还可以使用主单元库级库。建库使用的早期工程细胞株必须是通过克隆选择形成的均匀细胞群，必要时需要符合实际生产过程中使用的无血清培养基和培养条件的适应性培养。4.2建库细胞管理WCB不能在准备WCB的同时进行单克隆筛选，以避免由于单个基因突变而在WCB中改变细胞群体的遗传特性。要确保细胞库中每个容器内的内容物完全一致，例如培养细胞使用多个容器，就必须将所有培养盘内的细胞混合成一个批，然后分进去。为了防止细胞受到污染(微生物污染和实验室中其他种类细胞的交叉污染等)，在建立细胞库的过程中，必须采取适当的预防措施。上述各级种子库的细胞，必须按照特定要求彻底验证后才能使用(具体要求见本文的细胞库验证)。有关构建细胞库的特定过程、方法和管理要求，请参阅参考资料1。验证5芯库正确的起始细胞是实现良好生产的前提和基础。验证的目的是确认经过初步审查后捞出的细胞是否符合预定的设计要求，具有稳定的目的基因，以便持续表达功能性目的产物，不混合微生物污染或其他细胞，直接增设储备或应用于生产。对于原始库细胞和/或主要库细胞，一般需要包括遗传学、生物学、微生物学在内的全面系统的研究验证，严格控制从源头开始的细胞一致性，防止污染。从经过传代稳定性研究的初级细胞到工作细胞的简单传代及扩增可以集中检测外源因子污染，防止其他细胞混合，从而适当简化验证程序。保存的数量和传代水平必须保证生产用细胞的持续稳定供应。5.1细胞识别5.1.1细胞瘤的鉴定实现细胞的根，分析细胞的认同感，消除与其他细胞的交叉污染。目前常用的方法包括细胞生长特性和培养形态检查、从属特异性抗原检测、染色体核型分析、isoenzyme分析、限制性内切酶分析、基因多态性分析等。为了正确识别，必须适当地组合和选择特定细胞的独特特性。5.1.2肿瘤形成试验分析对象基因导入细胞后，应检测并分析肿瘤形成特性，对阳性细胞，探讨肿瘤形成变化对产品可能产生的安全风险的研究。5.1.3目的基因和表达框架分析目标基因和表达框架的确认是种子库细胞验证的重要组成部分，对表达正确的目标产物具有先决意义。一般方法是利用PCR通过标本DNA扩增或从细胞矩阵分离的RNA制造的cDNA进行DNA序列分析。通过限制性内切酶谱和南方杂交检测基因的完整性，确定目的基因的拷贝数，检测哪些序列插入或缺失等。基因序列分析资料应包括实验程序和阶段、原始序列图表、测量序列和翻译的氨基酸序列，实际测量序列和理论序列需要比较。请明确指出两者的异同。为了确保产品结构的准确性和稳定性，基因序列分析必须经过重组工程细胞的筛选和鉴定，细胞库的建立和验证，生产细胞培养监控的全过程。5.1.4表达产品检测必须检测被分析产品的表达及生物活性。活动测量对应于治疗机制，应选择可量化的方法。活性测定方法研究一致地进行了药物研究，并进行了相关的验证分析。5.2微生物污染检测5.2.1细菌、真菌和支原体检测必须彻底检查MCB、WCB和EPC(生产末期细胞)，在生产培养过程中监视细胞。具体方法见参考资料1。做支原体检测时要注意培养法和指示细胞法两者并行。必要的话，可以用扫描电子显微镜检查细胞是否被特殊微生物污染。5.2.2病毒因素检查包括细胞衍生宿主动物的潜在内源性病毒和工作引起的外源病毒的检查等。对细胞进行病毒检查的种类和方法应根据细胞的种类及组织来源、传代历史及细胞特性进行选择。5.2.2.1体外试验应该将MCB、WCB和EPC细胞活细胞或细胞分解产物接种到尽可能多的病毒敏感指标细胞。根据细胞来源，可以使用世代史及细胞培养基的原料选择适当的指示细胞。检查结果应该是阴性。具体方法见参考资料1。5.2.2.2体内试验接种老鼠、成年小鼠、鸡胚、豚鼠、兔子或其他敏感动物，在细胞培养物中检测潜伏病毒。通常执行MCB、EPC体内测试。具体方法见参考资料15.2.2.3种类特定病毒验证通过抗体生成测试，检测MCB细胞中可能存在的各种病毒，源于啮齿动物的细胞应进行小鼠、仓鼠或老鼠的抗体生成测试。严格控制危害人类的鼠性病毒。5.2.2.4逆转录病毒检测逆转录病毒检查应包括感染性检查、逆转录酶(RT)检查和电镜检查。MCB和EPC细胞的逆转录病毒检查应按照上述方法进行。5.2.2.4.1感染性试验您必须根据细胞特性和可能的逆转录病毒种类选择适当的检测方法，如XC plaque、延迟XC斑点检查、s l-焦点分析等。考试时要注意建立适当的阴阳对照组。5.2.4.2逆转录酶检测为了提高检测灵敏度，一般应通过适当的化学诱导剂诱导检测对象细胞，然后提取上清液，将其与检测细胞结合培养，然后测定逆转录酶活性，注意建立适当的音/阳性对照。5.2.2.4.3透射电镜检查通过透射电镜观察细胞基质微结构的形态特征和反转录病毒及病毒样粒子的存在，应与未被化学衍生物诱导的细胞进行比较。另外，细胞培养液超速离心后得到的沉淀物要负染色后检查。观察有无逆转录病毒粒子和粒子类型。上述三种方法具有不同的检测特性和灵敏度。因此，必须用其他方法共同测试。如果逆转录酶活性呈阳性，最好进行透射电镜检查或感染性检查，如果确认人或其他灵长类细胞有感染性逆转录病毒颗粒，那么这些细胞就不能用于生产。6细胞稳定性研究应包括库细胞、生产过程细胞、生产末期和/或生产末期等超过不同培养期的细胞。存储细胞应重点关注存储、复苏等操作处理因素的影响和传递过程中的遗传稳定性，并以此为基础确定库细胞传递极限。在生产过程中，细胞、生产末期和(或)生产末期细胞应观察模拟生产过程和培养条件对细胞生长状态、表达能力等的影响，并决定生产细胞增殖限制和(或)连续培养时间。使细胞总是能够固定地表达重组产品，并严格控制对最终产品产生安全影响的危险因素。6.1存储条件下的稳定性储存的细胞复苏用于生