1.基因工程的工具.ppt

专题复习,基因工程,生物组：刘婷,1.下列有关基因工程的叙述，正确的是A.基因工程培育作物新品种的原理是基因重组，而基因重组是随机的，所以通过基因工程改造后的品种，不一定是人们需要的B.导入的目的基因能在受体细胞中成功表达，是因为不同基因的空间结构、化学组成相同C.基因工程培育作物新品种不受生殖隔离的限制D.基因工程是在分子水平的操作，是人为增减或改变基因的某些碱基,C,一、概念,按照，进行严格的设计，并通过体外等技术，赋予生物以，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。在水平上进行设计和施工的，又叫DNA重组技术。,人们的愿望,定向,DNA重组和转基因,新的遗传特性,DNA分子,拼接基础,表达基础,打破物种界限,（基因拼接技术或DNA重组技术）生物体外基因DNA分子水平剪切拼接导入受体细胞表达人类所需要的转基因产物定向改造生物的遗传性状,基因工程操作环境：操作对象：操作水平：操作过程：结果：实质：,2、下列有关基因工程中工具酶的叙述，正确的是A.只能从原核生物中分离纯化限制酶B.限制酶从识别的特定核苷酸序列中轴线两侧将DNA的两条链分别切开，形成黏性末端C.DNA连接酶只能连接特定核苷酸序列的特定切点的磷酸二酯键D.在体外进行DNA复制时，可以用DNA连接酶代替DNA聚合酶,B,3、下列有关基因工程中载体的叙述，不正确的是A.除质粒外，某些病毒也可以做载体B.载体必须能自我复制，有限制酶的切点，标记基因可有可无C.基因工程中作载体的质粒，都是在天然质粒基础上人工改造的D.载体可将目的基因导入细胞质或细胞核,B,1.限制性核酸内切酶“分子手术刀”,来源：,能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂,形成DNA片段(限制酶切割DNA分子产生的DNA片段有两种形式，即粘性末端和平末端),二、工具,主要从原核生物中分离纯化得来,作用：,结果：,EcoR,Sma,2.DNA连接酶分子缝合针,将切下来的双链DNA片段“缝合”，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，拼接成新的DNA分子,E.coliDNA连接酶：只连接黏性末端,T4DNA连接酶：连接黏性末端和平末端但连接平末端的效率较低,是恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，即作用于磷酸与脱氧核糖之间而不是碱基对之间的氢键,作用：,作用实质：,基因工程使用的载体必须满足的条件:,载体DNA能够在受体细胞内保存下来并大量复制,载体DNA必须有一个或多个限制酶的切割位点,载体DNA必须带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选,载体DNA必须是安全的，不会对受体细胞有害,载体DNA分子大小应合适，以便提取和在体外进行操作,将目的基因送入受体细胞中,主要来自细菌并进行人工改造,3.基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,作用：,来源：,载体的种类,质粒、入-噬菌体和动植物病毒,质粒：是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子,质粒是基因工程中最常用的载体，常用大肠杆菌质粒。质粒的存在对宿主细胞无影响，复制只能在宿主细胞内完成,1.2基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的四个步骤,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中直接获取,1.基因文库：概念,2.基因文库的分类:,种类,基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库,3.获取目的基因的根据：,某生物体内全部DNA,许多DNA片段,受体菌群体,4.基因文库的构建方法,基因组文库,某种生物某个时期的mRNA,cDNA,受体菌群体,部分基因文库（cDNA文库）,5.基因组文库和部分基因文库(cDNA文库)比较,概念：PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、_、_、_,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA双链复制,已知基因的核苷酸序列（前提）,四种脱氧核苷酸,一对引物,耐热的DNA聚合酶（Taq酶）,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,(二)利用PCR技术扩增目的基因,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-60）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从引物处延伸，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,目的基因的mRNA,单链DNA(cDNA）,双链DNA(即目的基因),反转录,合成,2）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,1）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,（三）人工合成的目的基因,思考：供体中哪些物质能帮助我们获取目的基因？,供体中：DNARNA蛋白质,目的基因,所有DNA,构建,基因组文库,获取,所有RNA,构建,cDNA文库,目的基因的蛋白质,推测,目的基因的核苷酸序列,人工合成,目的基因所在DNA,PCR扩增,（引物）,目的基因的RNA,反转录,基因文库,1、下列有关基因文库的叙述中，说法正确的是A.可从人的基因组文库中获取胰岛素基因导入大肠杆菌，用来生产人的胰岛素B.在人的一个cDNA文库中，一定能找到胰岛素基因C.真核生物和原核生物的cDNA文库，均不含启动子D.根据目的基因表达的蛋白质，不能从基因文库中获取目的基因,C,2、有关PCR技术，下列说法错误的是A.PCR技术是利用DNA双链复制的原理B.PCR扩增目的基因的条件和体内DNA复制相同C.PCR技术需要的两种引物之间最好不互补D.PCR技术大量扩增两种引物之间的DNA序列,B,限制酶DNA连接酶载体,二、基因表达载体的构建,表达载体组成,所需工具,启动子终止子目的基因标记基因,质粒,DNA分子,限制酶处理,二个切口两个黏性末端,四个切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,过程:,DNA片断RNA聚合酶识别和结合的部位驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质,终止子：DNA片断能终止mRNA的转录,标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。,构建基因表达载体的目的：,启动子：,三、将目的基因导入受体细胞,方法,植物细胞,动物细胞,微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,受体细胞,体细胞受精卵,受精卵,钙离子处理,转化：,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞的方法：（1）农杆菌转化法农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,过程：,优点,（1）农杆菌转化法,（2）基因枪法（3）花粉管通道法,2、将目的基因导入动物细胞方法：显微注射法程序：,目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：,用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子,3、下列有关生产转基因植物的叙述，正确的是A.T-DNA是Ti质粒的标记基因B.农杆菌不易侵染单子叶植物，是因为单子叶植物损伤后不分泌酚类化合物C.将重组质粒导入农杆菌的目的是筛选含目的基因的重组质粒D.转基因植物自交后代，均可表现转基因后的新性状,B,鉴定（个体水平）,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,DNA分子杂交,分子杂交,抗原抗体杂交,四、目的基因的检测与鉴定,检测目的,分子水平,方法,供体获取,用于制备,转基因生物细胞中提取,转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,目的基因是否转录出了mRNA,目的基因是否翻译成蛋白质,目的基因,目的基因,目的基因表达的蛋白质,探针,探针,相应抗体,所有DNA,所有RNA,所有蛋白质,归纳:基因工程的基本操作程序,获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法（基因枪法、花粉管通道法）显微注射法Ca2+处理目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译鉴定：,4、科学家对一位缺乏腺苷酸脱氨酶（ada）基因而不能合成ada，患严重复合型免疫缺陷症的女孩进行基因治疗。方法是将患者的淋巴细胞取出做体外培养，然后用X病毒将正常ada基因转入淋巴细胞中，再将转基因淋巴细胞回输到患者体内。据此回答：(1)可以根据ada基因的设计引物用于PCR扩增a9da基因，PCR过程第一轮循环的模板是（该患者、正常人）的DNA。(2)X病毒的作用相当于基因工程操作工具中的。用H和P限制酶切取ada基因，则所选载体上应具有的酶切位点。,核苷酸序列,正常人,载体,H和P限制酶,4、科学家对一位缺乏腺苷酸脱氨酶（ada）基因而不能合成ada，患严重复合型免疫缺陷症的女孩进行基因治疗。方法是将患者的淋巴细胞取出做体外培养，然后用X病毒将正常ada基因转入淋巴细胞中，再将转基因淋巴细胞回输到患者体内。据此回答：(3)目的基因的受体细胞是(体细胞、受精