课题3　血红蛋白的提取和分离 (2).pptx

专题5课题3（第1课时）,岷县第一中学生物教研组何小彪,5.3血红蛋白的提取和分离,课题背景,蛋白质是生命活动的主要承担者，也是生命活动不可缺少的物质。2003年4月14日人类基因组序列图宣布完成，标志着人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此，从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作。,蛋白质分离的原理：,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。,一、基础知识,（一）凝胶色谱法,2.凝胶：,大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。,根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离。,1.概念：,（分配色谱法）,3.凝胶色谱法分离蛋白质的具体过程：,（1）演示：,（2）原理：,当不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小,相对分子质量较大,凝胶内部的通道,容易进入,无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较长移动速度较慢,路程较短移动速度较快,相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,（3）小结：,大于凝胶颗粒孔道直径,小于凝胶颗粒孔道直径,被阻挡在凝胶颗粒外面而迅速通过,因扩散进入凝胶颗粒内部而被滞留,较快,较慢,较短,较长,先,后,（二）缓冲溶液,能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。,1.作用:,2.缓冲溶液的配制:,通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。,3.还记得人体血液中的缓冲液吗？,H2CO3/NaHCO3NaH2PO4/Na2HPO4,4.在本课题中使用的缓冲液是:磷酸缓冲液,成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠,5.在血红蛋白实验中用缓冲液的目的是什么？,利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。,（三）电泳,1.概念：,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,2.原理：,3.类型:,由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速度决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同,在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，使其迁移速度完全取决于分子的大小,电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。,琼脂糖有一个相对较大的孔径，用来分离大分子例如核酸、大蛋白和蛋白复合物等，聚丙烯酰胺形成孔径较小的胶，适合于分离大多数蛋白和小片段核酸。,聚丙烯酰胺,丙烯酰胺和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下发生交联共聚反应形成。,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。,1.原理：,SDS（十二烷基硫酸钠）能使蛋白质发生完全变性，并能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。,2.SDS作用机理:,二、实验操作,第2课时内容（提前预习）,蛋白质的提取和分离一般分为四步：,样品处理,粗分离,纯化,纯度鉴定（电泳）,红细胞的洗涤,血红蛋白的释放,分离血红蛋白溶液,透析去除样品中分子量较小的杂质,用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的杂质,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,样品采集,1.随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是（）A.弄清各种蛋白质的空间结构B.弄清各种蛋白质的功能C.弄清各种蛋白质的合成过程D.获得高纯度的蛋白质,D,三、课堂检测,2.用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是（）A.相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B.相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C.相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大