课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (21).ppt

尿素CO(NH2)2重要的农业氮肥。只有被土壤中细菌分解为NH3才能被植物吸收利用,CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3,课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、研究思路,(一)筛选菌株,1、实例：寻找耐高温的DNA聚合酶,启示：,PCR技术：要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。,寻找目的菌种时要根据它对_，到相应的环境中去寻找。,生存环境的要求,耐高温的酶,耐高温生物体,耐高温环境（热泉、火山口）,寻找,寻找,Taq细菌,筛选原因:因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的Taq细菌保留下来。,2、实验室中微生物的筛选原理,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,思考：该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？,碳源：葡萄糖、尿素,氮源：尿素,此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？,原则上能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而生存。,3、选择培养基：,在微生物学中，将允许_，同时_生长的培养基。,特定种类的微生物生长,抑制或阻止其他种类微生物,结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板等方法对它进行纯化培养分离。,怎样证明此培养基具有选择性呢？,以尿素为唯一氮源的培养基,牛肉膏蛋白胨培养基,是,分离尿素细菌,判断该培养基有无选择性,只生长尿素细菌,生长多种微生物,是,如何对细菌进行计数？,1.显微镜直接计数法：,利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,（二）统计菌落数目,1、显微镜直接计数法（菌株）（必修3P68）,利用血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。由于此法计得的是活菌和死菌的总和，又称总菌计数法。,不能区分死菌与活菌；难以计数微小的细菌。,缺点,优点：直观、快速，能观察微生物的形态特征且技术简单,2、稀释涂布平板法（间接计数）,101,102,103,104,105,106,(二)统计菌落数目,1、方法运用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数。,2、原理1个菌落1个活菌,选择菌落数在30300的平板上计数。需培养计算出三个或三个以上的平板菌落求平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,3、注意事项,看课本P22，并讨论你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？,第一位同学：没有重复实验（至少涂布3个平板），结果无说服力。第二位同学：A组结果误差过大，可能存在操作失误，不应用于计算平均值,说明设置重复组的重要性。第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。这个实例启示学生，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。,4、计算公式：,某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml）()A.2.34108B.2.34109C.234D.23.4,B,每克样品中的菌株数=（CV）M,=平均菌落数所用涂布液的体积稀释倍数,(三)设置对照实验,阅读P2223页“（三）设置对照”一段讨论教材中提出的问题。,设置对照的目的：,排除实验组中非测试因素对试验结果的影响，提高实验结果的可信度。,(1)A同学出现此结果的可能原因？,培养基污染(或混入了其他的含氮物质)土样不同,(2)设置对照实验，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素？,这个实例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明_；如果结果不同，则证明A同学存在_,A无误,培养基的配制有问题,(培养基中混入了其他含氮物质)。,实验流程：,制备培养基土壤取样样品稀释取样涂布微生物的培养与观察细菌的计数,二、实验设计,（一）土壤取样,从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,土壤是“微生物的天然培养基”,数量最大、种类最多,大约70%90%是细菌,（二）制备培养基,制备选择培养基（尿素为唯一氮源）制备牛肉膏蛋白胨培养基相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。,（对照作用）,思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？,制备以为唯一氮源的培养基。,尿素,选择,碳源：氮源：,葡萄糖、尿素尿素,培养基的唯一氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。,（三）样品稀释涂布平板,稀释倍数为101106。每个稀释度均用3个选择培养基和1个牛肉膏蛋白胨培养基。,测定细菌的数量：一般选用104、105和106倍的稀释液测定放线菌的数量：一般选用103、104和105倍的稀释液测定真菌的数量：一般选用102、103和104倍的稀释液,（四）微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,1、培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：3037培养12d放线菌：2528培养57d霉菌：2528的温度下培养34d,2、不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。,菌落,菌落,（一）无菌操作1、取土用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都需要灭菌。2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。(二)做好标记注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。(三)制定计划对于耗时较长的生物实验，需要事先制定计划，以便提高工作效率，在操作时做到有条不紊。,三、操作提示,三、操作提示：,四、结果分析与评价,1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落？,对照的培养皿无菌落说明培养基没有污染。牛肉膏培养基的菌落数目多于选择培养基的菌落数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。,四.结果分析与评价,通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。,四、结果分析与评价,2.获得某一稀释度下，菌落数30300的平板，在这一稀释度下是否至少有两个平板的菌落数相接近？,相接近，说明操作成功，并能够进行菌落的计数。,3.提示：选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍数计算每克样品的菌数最合适。如选取的是同一种土样，同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确，分析原因。,五.课题延伸,对分离的菌种作进一步的鉴定:在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌。原理：脲酶催化尿素分解成氨培养基碱性增强,pH升高酚红变红脲酶阳性,五、课题延伸,1.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。,2.测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到伊红-美蓝培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。,大肠杆菌菌落呈黑色,有或无金属光泽,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征,本课题知识小结:,巩固练习,1.使用选择培养基的目的是（）A.培养细菌B.培养真菌C.使需要的微生物大量繁殖D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()A.CO2和N2B.葡萄糖和NH3C.CO2和尿素D.葡萄糖和尿素,C,D,3.下列说法不正确的是（）A.科学家从7080度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶。B.统计某