第五章血痕检验

.,第五章血痕检验,王伯平武汉大学医学院法医教研室,.,血痕的概念：血液在体外干燥后所形成的斑迹，称为血痕（Bloodstains）。血痕与血液是有区别的，血痕中红细胞被破坏，而血液中红细胞完整；血液中能检测的血型不一定能在血痕中检测出来。血痕检验时应注意节省检材，一般情况，应保留2/3以上以备复核鉴定。血痕检验的目的（1）是否是血；（2）是否是人血；（3）血痕的个人识别；（4）与案情有关的问题。,.,血痕检验的一般程序,.,第一节肉眼检验,一、血痕的部位二、血痕的颜色三、血痕的形状1、滴状形状决定于高度和方向。2、流注状多由静脉出血引起。3、喷溅状多由动脉出血引起。4、擦拭状特点是面积加大、浓淡不一、境界不清、平行线条状,.,.,二、血痕的形状,5、血印痕血手印、血足印、血鞋印是案件侦破的重要线索和证据。6、血泊血泊多为原始现场7、血水应仔细检查卫生间、洗手间有无血水8、隐性血痕9、其他,.,四、血痕的范围、搜寻和提取血痕的范围取决于出血量，根据血痕的大小可估计出血量。血痕在提取前，应拍照，提取时，应带手套，切不可用手拿检材，避免受污染检材。,.,第二节预试验,要求：（1）是血痕一定呈阳性（2）所需检材量少，灵敏度高（3）操作简便（4）快速预试验的特点是：灵敏度高、特异性不高。,.,一、联苯胺试验,1、原理血红蛋白或正铁血红素的过氧化物酶活性能催化过氧化氢释放新生态氧，氧能使无色的联苯胺氧化成蓝色的联苯胺蓝。2、试剂3、操作步骤注意试剂添加顺序不能颠倒4、注意事项,.,二、鲁米诺试验,1、原理血红蛋白的过氧化物酶活性能使过氧化氢释放新生态氧，氧能使不发光的鲁米诺氧化而发出荧光。2、试剂鲁米诺0.1g，无水碳酸钠5g，30%过氧化氢15ml，蒸馏水100ml，混合后溶解。3、操作将试剂装入喷雾瓶，在暗室内喷射。如是血痕则发强荧光。,.,.,注意事项;1、鲁米诺容易氧化，应临用时配置。2、适合于光线暗的地方寻找血痕。3、此法多血痕检验影响小，但多次喷射仍会对血痕检验有影响。4、此方法灵敏度高，特异性不高。,.,第三节确证试验,预试验只能说明可能是血，但不能肯定是血。可通过确证试验来确定是否是血痕。确证试验的方法有：血色原结晶试验、氯化血红素结晶试验、血细胞检查等。,.,血色原结晶试验,1、原理血红蛋白在碱性溶液中分解成正铁血红素和变性珠蛋白，在还原剂的作用下，正铁血红素还原成血红素，血红素与变性珠蛋白及其他含氮化合物结合，生成具有特殊吸收光谱的血色原结晶。2、试剂最好是配置后第二天使用3、操作4、注意事项(1)用新鲜试剂（2）可在酒精灯上稍微加热（3）血痕量少或被细菌污染，不形成结晶时可进行吸收光谱检查。（4）此结晶为血痕所独有，出现此结晶可判定含有血痕。(5)此实验灵敏度不高，阴性不能排除是血痕。（6）如采用具有种属特异性和器官特异性的抗人血红蛋白沉淀试验，此步骤可省略。,.,.,第四节种属鉴定,主要有三种方法：一、免疫学方法（1）沉淀反应（2）胶体金试剂条（3）ELASA法二、生物化学方法等电聚焦电泳三、DNA分析检测遗传标记,.,一、免疫学方法,1、沉淀反应原理：可溶性抗原与相应抗体在适当电解质条件下发生特异性结合，经过一段时间后形成肉眼可见的抗原抗体复合物沉淀。沉淀反应要求抗原抗体的比例要适当。抗原或抗体过多，会影响沉淀出现。另外还要注意其他的影响因素。操作方法（1）浸泡检材，上清液呈淡黄色时可进行下步试验。（2）取抗血清0.1ml加入沉淀管，然后取血痕浸液0.2ml缓慢加入沉淀管，两液面要清晰。（3）静置沉淀管，5、15、30、60观察一次。60不出现沉淀环为阴性。,.,.,2、胶体金试剂条,原理胶体金分子呈球形，能吸附蛋白质，用抗人血红蛋白单克隆抗体包被的胶体金分子，可形成布满抗人血红蛋白单克隆抗体的球形胶体金微粒。胶体金试剂条采用了免疫学抗原抗体特异性反应原理和层析技术原理，在加样后，由于吸附作用浸泡液向加样区的另一侧移动，如浸泡液中含有人血红蛋白，则与抗人血红蛋白胶体金微粒结合形成人血红蛋白-抗人血红蛋白胶体金微粒的复合物，复合物继续向另一侧移动，当遇到抗血红蛋白抗体时（检测线），人血红蛋白-抗人血红蛋白胶体金微粒复合物中的血红蛋白与检测线上的抗血红蛋白抗体产生抗原抗体反应，则停留于此，浓度逐渐增高，形成肉眼可见的红色反应线。部分抗人血红蛋白胶体金微粒继续向另一侧移动，当遇到羊抗鼠IgG(单克隆抗体为鼠抗体）,抗人血红蛋白胶体金微粒上的抗人血红蛋白抗体（鼠抗体）与羊抗鼠IgG发生抗原抗体反应，停留于此（质控线），形成肉眼可见的另一条红色反应线。,.,2、胶体金试剂条,结果判断,.,3、ELASA法检测人的IgG，酶标记的抗人IgG具有种属特异性。二、等电聚焦电泳人和其他动物的血红蛋白的一级结构不同，因此他们的血红蛋白的等电点不同，经过等电聚焦电泳后，蛋白质在凝胶上的位置不同，根据蛋白质谱带在凝胶上的位置可确定是否是人血。采用等电聚焦电泳不仅可检测是否是人血痕，还可判断出是何种动物血痕。,.,三、DNA分析技术,1、28SrRNA人类的RNA80%为rRNA，rRNA有60S和40S亚基组成。60S亚基由28S、5.8S、5S三个亚基组成。其中28S亚基在大部分区域具有高度保守性，在进化过程中变异不大，但其中的可变区进化较快，种属间变异较大，针对这些可变区设计相应的引物，可检测是否是人血，必要时可检测出是何种动物血。,.,.,三、DNA分析技术,2、CytB基因mtDNA中的CytB基因具有种属特异性，针对这些特征设计相应的引物，可检测是否是人血，必要时可检测出是何种动物血。3、其他的DNA片段或基因如ALU家族、人肌红蛋白基因、SON基因，另外一些STR位点也具有种属特异性。,.,第五节个人识别,血痕的个人识别检测的遗传标记有两大类：（1）血型；（2）DNA片段。一、ABO血型检测血痕的ABO血型检测有两种途径：（1）检测凝集原（2）检测凝集素,.,1、凝集素的测定原理：在人的血痕中有与该个体血液相同抗A、抗B。用生理盐水浸泡血痕时，干燥的凝集素被溶出，与相应的红细胞相遇时发生凝集反应。根据凝集的情况可判断血痕含有何种凝集素，然后可推知是何种血型。值得注意的是此方法不一定都能检测出相应的凝集素，因此通常检测的是血痕中的凝集原。,.,2、凝集原的检测（1）吸收试验原理,.,（1）吸收试验注意事项：A、此试验必须有空白、已知A、已知B血痕作为阴性和阳性对照，只有在对照准确时才可下结论。B、血痕与空白检材的凝集管数相差3级以上，才能说明检材中含有相应的凝集原。C、如未检测出A、B凝集原，还要检测H抗原，H抗原阳性，说明是O型；阴性说明血痕过于陈旧或血痕被破坏。D、此方法需要的检材量大，对于检材量少的血痕无法进行吸收试验，可改用灵敏度更高的解离试验进行ABO血型的检测。,.,（2）解离试验特点：A、灵敏度高，只需少量检材。B、节省时间C、所需设备简单D、可检测MN、Rh等血型E、可检测血痕外的其他生物学检材，如毛发、指甲、骨骼、体液和分泌液等,.,（2）解离试验原理,.,操作步骤结果判断,注意事项1、浸泡的抗体效价和洗涤时间非常重要。抗体效价过高，会产生假阳性，洗涤时间过长会出现假阴性。2、解离试验必须有已知A、已知B型人血、空白检材作对照，只有在对照准确时，才能下结论。3、如果A、B血型凝集原都未检测出，不一定说明是人血。此时还需检测H抗原，如检测出H抗原，说明是O型；另外还可以检测血痕中凝集素，如在凝集素检测中，能检测出抗A和抗B，则可肯定是O型。,.,二、其他血型的测定血痕除了可检测出ABO血型之外，还可检测MN血型、Rh血型、HP型、GC型、PGM1型等。MN血型、Rh血型可采用吸收试验、解离试验。具体方法与ABO血型类似。HP型、GC型、PGM1型等血清型、红细胞酶型与其新鲜血的检验类似，但有些区别。在有些血痕中，有时可检测出ABO血型，其他血型不能检测出（由于这些血型物质没有ABH抗原稳定，易遭到破坏）。,.,二、DNA遗传标记的检测,DNA遗传标记的发展有三个阶段：1.DNA指纹技术2.PCR-STR技术3.PCR-SNP技术,.,PCR-STR技术所得的DNA分析图谱,1、2、3为不同物体上附着的血痕,经多个STR位点分析后,证实1、3来自同一个人,以上取自其中6个基因位点.,123123123123123123,.,第六节血痕的其他检验,一、出血部位的判断出血部位的鉴定主要根据血痕中的特殊细胞来检验的。二、出血量的测定血量=干血量1000/211三、出血时间的推断主要根据1、血清氯的渗润2、溶解度3、血痕的颜色,.,1、血清氯的渗润原理：血痕中氯随着时间发展，氯向周围扩散，用硝酸银测定氯渗润的范围，从而推断血痕经过的时间。此方法受湿度影响大，湿度高，血清氯的渗润范围会增大。此方法受血痕所附着的检材影响更大，在铁器上附着的血痕血清氯的渗润范围肯定比在滤纸上附着的血痕血清氯的渗润范围小得多。,.,2、血痕的颜色,鲜红色,暗红色,暗褐色,灰色,.,四、性别的鉴定,性别的鉴定主要方法有：（一）性染色质检查（二）性激素检查（三）Amelogenin基因人类的牙釉基因（Amelogenin基因）位于人类的X染色体上。Y染色体上有类牙釉基因，与X染色体上牙釉基因90%同源。用一对引物扩增X染色体上牙釉基因和Y染色体上的类牙釉基因，可得到X染色体上的片段（977bp)，及Y染色体上的片段（788bp)。ABI公司的个人识别的试剂盒可检测16个位点，其中包括15个STR位点和1个Amelogenin基因位点。但Amelogenin基因有印度学者报道在印度人群中缺失率为2%，在我国也有报道Amelogenin基因扩增时，X染色体上没有基因产物。与Amelogenin基因类似的还有ZFY/ZFX基因，设计一对引物进行PCR扩增ZFY/ZFX基因，ZFY长度为340bp,ZFX长度为488bp。,.,.,（四）Y染色体上的DNA片段和基因1、SRY基因SRY基因是哺乳动物的性别决定基因，位于Y染色体上。通过扩增SRY基因可进行性别鉴定。有PCR产物，说明是雄性，没有PCR产物说明是雌性。2、Y染色体上的STRY-STR位于Y染色体上的非重组区。通过扩增Y-STR可进行性别鉴定。有PCR产物，说明是雄性，没有PCR产物说明是雌性。3、其他Y染色体上的遗传标记如扩增Y染色体的DYZ序列等。用这些Y染色体上的DNA片段和基因的缺点是它可能将男性的血痕（血痕被破坏）没有PCR产物当成是女性，因此在用这些Y染色体上的DNA片段和基因时，必须还要配套的通过PCR扩增检测X染色体上的DNA片段或常染色体上的基因位点作为对照。,.,五、一人血或多人血的鉴定,在有些案件中血痕可能有两