关于乳链菌肽的资料

浙江理工大学生科院科研实践报告 乳链菌肽（nisin）产生菌的筛选及其代谢产物活性的研究 生命科学学院科研实践总结报告题目:乳链菌肽（nisin）产生菌的筛选 及其代谢产物生物活性的研究 专 业： 生 物 技 术 班 级： 06（1）班 姓 名： 李 兴 指导教师： 南 旭 莹 学 号： M06860119 学 期： 09/10学年第一学期 实习时间： 第4-10周 2009 年 12 月 24 日乳链菌肽（nisin）产生菌的筛选及其代谢产物生物活性的研究国外对Nisin 的研究较早。1928年，L.A.Rogers 等首先发现乳酸链球菌代谢产物能抑制乳酸杆菌的生长；1933年，Whitehead分离出这种物质，并证明它是一种多肽；1947年，英国的Mattick等证明该物质可抑制许多革兰氏阳性菌，因乳酸链球菌在分类上属血清学N 群，故将其产生的具有蛋白性质的抑制物命名为Nisin (来源于Group Ninhibitory substance)1；1953 年，Nisin的第一批商业产品 Nisaplin在英国面市；1969 年，FAO/WHO联合食品添加剂专家委员会确认Nisin可作为食品添加剂。1990年我国卫生部将其列入GB2760- 86的1990年增补品种中，可用于罐头食品、植物蛋白食品、乳制品和肉制品中2。目前，已经有60 多个国家和地区批准Nisin可作为一种纯天然食品防腐剂、保鲜剂使用3。Nisin是目前世界上唯一允许使用在食品方面的抗菌素。Nisin在食品的应用极为广泛，可用于奶油、巧克力、有机酸、多糖、氨基酸和维生素发酵工业中，减少G+ 菌的污染4。随着经济的发展，人们生活水平的提高，健康食品、绿色食品的概念越来越被人们接受，对高效、无毒的天然防腐剂的研究和应用也越来越引起人们的重视。Nisin作为一种高效、无毒的天然食品添加剂符合未来食品防腐剂的发展趋势，相信Nisin在食品工业将会发挥更大的作用。本实验利用nisin产生菌中编码乳酸链球菌素前体的基因（nip+）和其抗性基因(nisr）以及蔗糖发酵基因(suc+)紧密连锁的原理5,6，在添加nisin、蔗糖及溴甲酚紫的选择培养基上直接、定向筛选nisin产生菌。1.材料与方法1.1 主要材料鲜牛奶（取自杭州近江奶牛场）乳链菌肽标准品（效价1300IU/g，购自浙江银象生物工程有限公司）1.2 主要仪器灭菌锅，恒温摇床，恒温培养箱，高速离心机，SDSPAGE凝胶电泳仪1.3 主要试剂配方7,81.3.1 乳酸菌增殖培养基胰蛋白胨5.0g蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，酵母浸膏2.5g，抗坏血酸05g，硫酸镁0.25g， 甘油10.0 g 葡萄糖3.0g，磷酸氢二钾5.0g，蒸溜水lO00mL。调节pH 至6.90.2，121oC蒸汽灭菌15min备用（使用时添加乳链菌肽，20IU/ml）1.3.2 乳酸菌选择培养基胰蛋白胨5.0g蛋白胨5.0g，牛肉膏5.0g，酵母浸膏2.5g，抗坏血酸05g，硫酸镁0.25g， 甘油10.0 g 蔗糖3.0g，磷酸氢二钾5.0g，蒸溜水lO00mL。调节pH 至6.90.2，121oC蒸汽灭菌15min备用（使用时添加乳链菌肽，50IU/ml；溴甲酚紫，0.004%）1.4 实验内容1.4.1 富集培养将新鲜牛奶样品以10% 接种量分别接种于含乳链菌肽(20IU/ml )的GMl7培养基中，37增殖培养24 h。1.4.2 选择培养取100l增殖培养液涂布于筛选培养基（含乳链菌肽，50IU/ml）上，3O培养24h。挑取周边培养基变黄的菌落，富集培养后，再次在选择培养基上划线分离单菌落。1.4.3 纯化培养将筛选出的菌株通过在选择培养基上进行划线培养得到纯化后的单一菌落。1.4.4 SDSPAGE凝胶电泳检验菌种的代谢产物9富集培养目的菌种后，用HCl将菌液调至pH=25，90 加热30 min，5400 rmin离心12 minute，收集上清液备用。将各个菌株处理后的发酵液与标准品nisin进行SDSPAGE凝胶电泳。2.结果与分析2.1 经富集培养后的液体培养基如下图： 2.2 纯化后的菌株（部分） 纯化后的菌株长出的菌落为乳白色，在无氧条件下生长较快，而在有氧条件下则生长较为缓慢2.3 SDSPAGE凝胶电泳为了节省研究资源，因此先对目的菌株的发酵液进行SDSPAGE凝胶电泳,以确定其代谢产物中是否存在乳链菌肽，目的菌株发酵液的凝胶电泳图如下：3.结论由于乳链菌肽的分子量较小，此次所选用的Marker无法分辨出，因此根据目前电泳结果还无法判断目的菌种的代谢产物中是否存在乳链菌肽，鉴定工作还需继续。参考文献1 Rutt Suttisri, Ik- Soo Lee. Plant - derived triterpencid sweetness inhibitorsJ. Journal of Ethnopharmacology. 1995, (47): 9- 26.2 凌关庭. 天然食品添加剂手册M. 北京: 化学工业出版社, 2000.3 薛禹各. 一种有希望的天然食品防腐荆一乳酸链球苗肽J. 干旱区研究, 1992, 2: 49-53.4 王岁楼. 天然食品防腐剂尼塞的研究J. 食品科学, 1990, 4: 48-51.5 姜延龙, 霍贵成. Nisin生物合成相关基因分析J. 生物技术, 2005, 15(2): 79-81.6 Igor M, MIchiel K. 10 years of the nisin-controlled gene expression system (NICE) in Lactococcus lactis J. Microbiol Biotechnol, 2005, 68(6): 705-717.7 曹文海, 任国谱. 嗜热链球菌的检验培养基(M17)的改良J. 中国乳业, 2006, 01: