维生素类药物分析讲义PPT课件VIP

维生素类药物的分析,第九章,主讲人肖国君,维生素：是维持人体正常代谢机能所必需的微量营养物资。人体不能合成维生素。,脂溶性,VitA、D、E、K1等,水溶性,VitB族(B1、B2、B6、B12)VitC、叶酸、烟酸、烟酰胺,VitPP,-H维生素A醇-COCH3维生素A醋酸酯-COC15H31维生素A棕榈酸酯,R:,第一节维生素A的分析,一、结构与性质,具有共轭多烯醇侧链的环己烯,1,2,3,4,5,6,7,8,9,.,4,具有UV吸收,存在多种立体异构化合物,易发生脱氢、脱水、聚合反应,易被氧化,性质,VitA,紫外线、O2、氧化剂,环氧化物,O,VitA醛或酸,维生素A全反式325.5100%新维生素Aa2-cis32875%新维生素Ab4-cis320.524%新维生素Ac2，4-dicis310.515%异维生素Aa6-cis32321%异维生素Ab2,6-dicis32424%,相对生物效价,结构,去氢,脱水,VitA2,VitA3,聚合,鲸醇,VitA,环氧化物,VitA醛,VitA酸,（一）三氯化锑反应,CHCl3,二、鉴别试验,条件无水、无醇,VitA,SbCl3,蓝色,紫红色,（二）UV法,BP,VitA,无水乙醇,HCl,去水VitA,max为326nm一个吸收峰,max为350390nm三个吸收峰,VitA,去水VitA（VitA3）,BP、USP对照品法显色剂磷钼酸,（三）TLC法,三、含量测定,（一）UV法,立体异构体氧化产物及光照产物合成中间体去氢维生素A（VitA2）去水维生素A（VitA3）,三点校正法,VitA的含量表示-生物效价（IU/g）,1IU=0.344ug全反式VitA醋酸酯=0.300ugVitA醇,VitA醋酸酯,VitA醇,1IU,0.344ug,0.300ug,效价（1IU/g）,2.907106,3.33106,1900,328nm,1530,325nm,1820,1830,(换算因子),InternationalUnit,结果计算公式为：,效价,=,=,换算因子,第一法等波长差法测定对象VitA醋酸酯,328-316=340-328,第二法等吸收度法(皂化法)测定对象VitA醇,6/7A1=A2=A3,波长的选择,三点校正法,三点校正法第一法等波长差法,316,328,340,第二法等吸收比法,A2=A3=6/7A1,测定方法,1、第一法维生素A醋酸酯,按表中各波长分别测定吸收度，计算Ai/A328,规定吸收度比值,判断方法,（1）若max=326329nm,(Ai/A328)测-规定值0.02则用A328处的测得值计算。,（2）若max=326329nm,有(Ai/A328)测-规定值0.02则用校正公式校正后计算f值再判断：A328（校正）=3.52（2A328-A316-A340）,若f值在3%以内，仍以未校正的A328计算。,若f值在-15%-3%以内，用校正后的A328（校正）计算。,若f值3%或0.73，则用色谱法测定。,（二）三氯化锑比色法标准曲线法,优点简便快速,max618nm620nm,缺点,呈色不稳定（510s内）,水分干扰,与标准曲线温差1,专属性差,三氯化锑有腐蚀性,（三）HPLC,RP-HPLC同时测定人血清中VitA和VitE含量,色谱条件,色谱柱：C18流动相：甲醇-水流速：1.2ml/min检测波长与AUFS：08min(330nm,0.25AUFS);8min后(292nm,0.05AUFS)内标：VitA酯,VitA,VitE,苯并二氢吡喃环，带有脂肪侧链R1、R2和乙酰化酚羟基，又称生育酚醋酸酯。,一、结构与性质,第二节维生素E的分析,名称,R1,R2,相对活性,-生育酚,-生育酚,-生育酚,-生育酚,CH3,CH3,H,H,CH3,H,CH3,H,1.0,0.5,0.2,0.1,性质：,1、苯环-UV法,2、酯键-易水解，水解产物生育酚易被氧化。,3、有手性碳原子-有立体异构体。天然产品一般是d型（右旋），合成品是消旋体（dl型）,VitE(dl-TocopherylAcetate),7515,（一）硝酸反应,橙红色,二、鉴别试验,VE,HNO3,生育红,生育酚,HNO3,生育红（橙红色）,（二）三氯化铁联吡啶反应,VE,KOH,生育酚,Fe3+,对-生育醌,Fe2+,2，2-联吡啶,血红色,生育酚,Fe3+,对-生育醌,红色,（三）UV法,0.01%无水乙醇中max=284nmmin=254nm,=41.045.5,维生素EUV图,薄层板硅胶G,展开剂环己烷-乙醚（4：1）,显色剂硫酸（1055）,VitERf=0.7,无水乙醇,2Ce4+,+2Ce3+,利用生育酚的易氧化性,原理,（一）,三、杂质检查,VitE醋酸酯中生育酚的检查：铈量法,滴定剂：硫酸铈滴定液Ce(SO4)2（0.01mol/L）终点指示：二苯胺（亮黄灰紫）,二氢吡啶类药物：邻二氮菲-亚铁,吩塞嗪类药物：自身指示法,取本品0.10g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液1滴，用硫酸铈液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸铈液（0.01mol/L）不得过1.0ml。,例,2.15,规定限量,若硫酸铈液浓度不是0.01000mol/L，应重新计算硫酸铈的消耗量,（二）注意,设：应消耗硫酸铈液Vml,0.011.0实际浓度V,四、含量测定,GC法加校正因子内标法ChP,（一）,1、,1、VitE测定的色谱条件,载气：N2固定相：硅烷化硅藻土上涂布硅酮（OV-17）柱温：265检测器：氢火焰离子化检测器(FID)内标：正三十二烷n500R2,内标物,是样品中不存在的物质与被测组分峰靠近能与各组分完全分离与被测组分的量接近,ChP和BP内标正三十二烷,USP内标十六酸十六醇酯,2测定,供试液：样品+内标,对照液：对照+内标,（1）系统适用性试验对照液（对照+内标）进样理论塔板数N应不低于500，VE与内标峰分离度应大于2。,（2）校正因子的测定对照液（对照+内标）进样,（3）样品测定供试液（样品+内标）进样,s-内标r-对照,样品：dl生育酚固定相：十八烷基硅烷键合硅胶流动相：甲醇-水（49：1）检测波长：292nm,（二）RP-HPLC法（外标法）JP,用峰高计算含量：,W生育酚=,W对,H对,H样,（三）FLD同步荧光扫描法,血清中维生素E的测定：,维生素E和溶剂的拉曼光谱重叠,激发波长295nm,氨基嘧啶环CH2噻唑环(季铵碱),第四节维生素B1的分析,一、结构与性质,HCl,Cl-,1、共轭双键：UV（max=246nm）,性质:,可与酸成盐；非水碱量法4、嘧啶环N原子可与生物碱沉淀剂反应（鉴别和硅钨酸重量法）,3、碱性N原子：嘧啶环上伯氨基噻唑环上季铵,2、噻唑环含S原子：硫色素荧光法分解产物与Pb(AC)2反应,荧光消失,蓝色荧光,硫色素,正丁醇提取,NaOH,VitB1,（一）硫色素反应ChP,K3Fe(CN)6+4NaOH,H+,3K4Fe(CN)6+Na4Fe(CN)6+O2+2H2O,二、鉴别试验,K3Fe(CN)6,硫色素,(O),-2H,H+,H+,H+,H+,（二）沉淀反应,VitB1,S元素反应,Cl-反应,（三）其他反应,VitB1,NaOH,Na2S,Pb(AC)2,PbS(黑色),三、含量测定,加入醋酸汞消除盐酸盐的干扰。指示剂：喹那啶红亚甲蓝（紫红天蓝）,（一）非水溶液滴定法ChPBP,（二）UV法,中国药典中VitB1片剂和注射液均采用本法测定含量。,max=246nm,（三）硅钨酸重量法ChP（90年版）以前用,1原理,2C12H17ClN4OSHCl+SiO212WO326H2O,H+,(C12H17ClN4OS)2SiO2(OH)212WO34H2O+HCl+4H2O,白色,2337.27,3479.22,2VitB1,硅钨酸,（VitB1)2硅钨酸,取本品约50mg，精密称定，加水50ml溶解后，加盐酸2ml，煮沸，立即滴加硅钨酸试液4ml，继续煮沸2分钟，用80恒重的垂熔玻璃坩埚滤过，沉淀先用煮沸的盐酸溶液（120）20ml分次洗涤，再用水10ml洗涤1次，最后用丙酮洗涤2次，每次5ml，在80干燥至恒重，精密称定，所得重量与0.1939相乘，即得,2、测定方法,（1）硅钨酸用量：过量VB1:硅钨酸=1:8,（2）沉淀反应在HCl中进行，增大沉淀颗粒,实验条件：,（3）煮沸：2-3分钟。太长，沉淀易附着于器壁而损失。（4）洗涤：热的稀HCl、水、丙酮洗。（5）干燥：80保持4个H2O,（四）硫色素荧光法,1、原理2、方法,+NaOH+铁氰化钾+异丁醇+NaOH+异丁醇,S,d（空白）,对照液,供试液,+NaOH+铁氰化钾+异丁醇+NaOH+异丁醇,b（空白）,A,C样,A-b,C对,=,S-d,C样=C对,A-b,S-d,.,63,(五)高效液相色谱法,例如：甲硫氨酸维B1注射液中甲硫氨酸和维B1的含量测定,方法：色谱柱：C18流动相：(A)0.005molL庚烷磺酸钠溶液(磷酸调pH至3.0)与(B)乙腈为流动相，梯度洗脱检测波长为210nm;,甲硫氨酸,VB1,.,64,(六)流动注射化学发光法,维生素B1在碱性介质中被铁氰化钾氧化，产生微弱化学发光,罗丹明B可快速吸收反应释放的能量而跃迁至激发态，以光辐射的形式返回基态，十六烷基三甲基溴化铵(CTMAB)可敏化其发光强度，使光强度大大增强。,A样品+CTMABB罗丹明BC铁氰化钾+NaOHP蠕动泵F流通池,1、罗丹明B-CTMAB化学发光法,可用于测定维生素B1片和注射液,V进样阀PMT光电倍增管,.,65,VB1和KIO4在酸性介质中的反应为常规的氧化-还原反应,不产生化学发光。反应剩余的KIO4注入到Luminol流路中,KIO4与Luminol在混合管中发生化学发光反应,但因反应灵敏,在未到达检测器之前反应已经完成,故此发光强度未被检测,然后剩余的Luminol继续与Na2SO3发生化学发光反应而在发光流通池中被检测,其发光强度与维生素B1的浓度在一定的范围内呈良好的线性关系。,2、FI-化学发光法间接测定,（七）分光光度法,维生素B1在pH2的盐酸溶液中以分子状态存在,稳定性良好,但pH大于5时,将会分解。在pH7时维生素B1完全分解。利用光谱差异测定。测定波长：249nm,1、差示分光光度法,2、动力学光度法,在氢氧化钠介质中,维生素B1能灵敏催化高碘酸钾氧化苯并红紫4B使之褪色,在一定范围内,苯并红紫4B褪色程度与维生素B1浓度成正比,3、酸性染料比色法,利用维生素B1与酸性染料溴麝香草酚蓝成盐,在420nm波长处测定吸收度,.,67,(八)Fe()-2,2联吡啶分光光度法,(九)电位滴定法,用银电极为指示电极,甘汞电极为参比电极,AgNO3标准溶液为滴定剂,第五节维生素C的分析,L抗坏血酸,一、结构与性质,*,*,1、多羟基化合物：具糖的性质,性质:,2、2，3-烯二醇结构：强还原性氧化还原滴定法,3、C3-OH:酸性,一元酸，可与Na2CO3成盐,(O),5、水解反应：与碱反应,6、UV特征,4、手性C原子（C4、C5）：具旋光性，L(+)抗坏血酸活性最强,max=243nm,（一）与氧化剂的反应,二、鉴别试验,Cu2O（红色）,VitC,AgNO3,Ag（黑色）,2，6-二氯靛酚钠,兰色消失,KMnO4,紫红色褪去,Felling试剂,（三）UVBP,0.01mol/LHCl,（二）糖类的反应USP,VitC,三氯醋酸或盐酸,戊糖,脱水,糠醛,吡咯,50,max=243nm,=545-585,蓝色,指示剂淀粉指示液,三、含量测定,H+,（一）碘量法ChP,（1）溶解：加新沸的冷H2O，减少水中溶解氧对测定的影响,（2）酸性环境：HAC，减慢VitC被O2氧化速度,（3）立即滴定：减少O2的干扰,（4）附加剂干扰的排除,片剂滑石粉过滤,注射剂抗氧剂,丙酮甲醛,Na2SO3,NaHSO3，Na2S2O3,Na2S2O5,2、讨论,（二）2，6-二氯靛酚钠滴定法USP、JP,VitC+,去氢VitC+,（玫瑰色）,（无色）,以出现玫瑰色为终点,缺点：,滴定液不稳定，需经常标定,干扰多氧化力较强,（三）HPLC法,HPLC法测定制剂、生物样品、果汁中维生素C,方法离子交换色谱法离子对色谱法分配色谱法（正、反相）,血、尿、组织、细胞等,检测器：紫外、安培检测器,例如：RP-HPLC测定多维软咀嚼片中维生素C含量,色谱柱:HypersilC18柱;流动相:0.005molL-1磷酸二氢钾溶液(用磷酸调pH至3.6);检测波长:246nm。,1、2,4-二硝基苯肼比色法,（四）分光光度法,例如：不同产地枸杞子中维生素C含量测定,2、胶束增溶分光光度法,维生素C还原氯化硝基四氮唑蓝(NBT)为蓝色化合物,蓝色化合物被溴代十六烷基吡啶(CPB)在水溶液中形成的胶束增溶,使显色反应灵敏度显著提高。,3、紫外分光光度法,4、邻二氮菲分光光度法,利用抗坏血酸与0.05%Fe()-1,10-二氮杂菲溶液在pH=26的盐酸介质中生成Fe(),Fe()与啉菲罗啉形成有色络合物,其吸光值与抗坏血酸的浓度成正比,测定药剂中维生素C含量。,5、流动注射光度法,（五）荧光法,快速循环伏安法,采用L-赖氨酸修饰玻碳电极，以磷酸盐缓冲溶液为支持电解质,（六）电极法,第五节维生素D的分析,胆甾醇,7-脱氢胆甾醇,维生素D3,麦角甾醇,维生素D2,维生素D2维生素D3,溶解性不稳定性旋光性显色反应紫外吸收,二、鉴别,三