药物分析第三章.ppt

第三章,分析样品的制备,第一节化学原料药分析样品的制备,化学原料药分析样品的制备方法通常可分为三大类：直接溶解法化学分解法有机破坏法,药典中收载的一些含卤素与金属的有机药物，随其在分子结构中结合状态的不同，分析前要经过不同的前处理过程，方可测定。,有机卤素药物：,含卤素有机药物系指药物分子结构中所含卤素直接与芳环或脂肪链相连者，而不包括某些有机药物的卤酸盐或氢卤酸盐。,结构特点：CX,（一）卤原子的活泼性,卤原子与碳原子直接相连，卤原子的活泼性和它直接相连的烃基的结构有很大关系。,乙烯型卤和芳卤不活泼,烯丙型卤和苄卤活泼,卤代烷型介于两者之间,2.分子中所含卤原子的个数,分子中所含卤原子的个数越多，活泼性越强。,三氯叔丁醇,六氯对二甲苯,泛影酸,碘番酸,碘苯酯,磺溴酞钠,（二）定量分析前处理方法,直接回流后测定法酸性或碱性还原后测定法氧瓶燃烧分解后测定法,含金属有机药物：,含金属的有机药物：金属原子不与碳原子直接相连，通常为有机酸及酚的金属配位化合物。如：酒石酸锑钾、葡萄糖酸锑钠、富马酸亚铁。,葡萄糖酸锑钠,酒石酸锑钾,富马酸亚铁,有机金属药物：金属原子直接与碳原子以共价键相连，结合比较牢固。如：卡巴胂、醋酸苯汞、汞撒利,卡巴胂,醋酸苯汞,汞撒利,一、直接溶解法,当药物结构中具有可检测官能团时，可直接使用适当溶剂溶解后采用合适的方法测定。如某些药物难溶于常规有机溶剂，可加热简单方法释放官能团。,葡萄糖酸钙配位滴定法,取本品0.5g，精密称定，加水100ml，微温使溶解，加氢氧化钠试液15ml与钙紫红素指示剂0.1g，用乙二胺四乙醋酸二钠滴定液（0.05mol/L）滴定至溶液自紫色转变为纯蓝色。每1ml乙二胺四乙醋酸二钠滴定液（0.05mol/L）相当于22.42mg的C12H22CaO14H2O。,富马酸亚铁氧化还原滴定法,取本品约0.3g，精密称定，加稀硫酸15ml，加热溶解后，放冷，加新沸过的冷水50ml与邻二氮菲指示液2滴，立即用硫酸铈滴定液（0.1mol/L）滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml硫酸铈滴定液（0.1mol/L）相当于16.99mg的C4H2FeO4。,葡萄糖酸锑钠的测定,取本品约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水100ml、盐酸15ml与碘化钾试液10ml，密塞、振摇后，在暗处静置10min，用硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每lml的硫代硫酸钠滴定液(0.1mol/L)相当于6.088mg的Sb。,二、化学分解法,药物结构中存在潜在的活性基团，可将药物结构部分分解后测定。,1.碱水解法,（一）水解法,三氯叔丁醇的测定Ch.P.（2010）,取本品约0.1g，精密称定，加乙醇5mL溶解后，加20%氢氧化钠溶液5mL，加热回流15min，放冷至室温，加水20mL与硝酸5mL，精密加硝酸银滴定液,（0.1mol/L）30mL，再加邻苯二甲酸二丁酯5mL，密塞，强力振摇后，加硫酸铁胺指示液2mL，用硫氰酸胺滴定液（0.1mol/L）滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1mL硝酸银滴定液（0.1mol/L）相当于6.216mg的C4H7Cl3O1/2H2O。,2.酸水解后测定法醋氨苯砜的含量测定：在酸性溶液中水解，芳酰胺基水解为芳伯氨基，亚硝酸钠滴定法测定含量,（二）碱性还原法,在碱性溶液中加还原剂（如锌粉）回流，使卤素与碳结合键断裂，形成无机卤后测定。,本法适用于测定结构中碘与苯环直接相连，且一个苯环上含多个碘原子的含卤素有机药物。,泛影酸的测定Ch.P.（2010）,取本品约0.4g，精密称定，加氢氧化钠溶液30mL与锌粉1.0g，加热回流30min，放冷，冷凝管用少量水洗涤，滤过，烧瓶与滤器用水洗涤3次，每次15mL，洗液与滤液合并，加冰醋酸5mL与曙红钠指示液5滴，用硝酸银滴,定液（0.1mol/L）滴定。每1mL硝酸银滴定液（0.1mol/L）相当于20.46mg的C11H9I3N2O4。,Ch.P.（2010）收载的胆影酸、碘番酸、胆影葡胺、泛影葡胺、碘他拉酸等均采用同法测定。,碘番酸的测定JP,取本品的干燥品约0.4g，精密称定，加锌粉1g及冰醋酸10mL，加热回流30min，放冷，冷凝管用水30mL洗涤，用脱脂棉过滤，烧瓶与脱脂棉用水洗涤2次，每次20mL，洗液与滤液合并，加四溴酚酞乙酯指示液1mL，用硝酸银滴定,液（0.1mol/L）滴定。终点时黄色沉淀变为绿色。每1mL硝酸银滴定液(0.1mol/L)相当于19.031mg的C11H12I3NO2。,三、有机破坏法,含金属、卤素、氮、硫、磷等有机药物结构中的待测原子与碳原子结合牢固者，用水解或氧化还原法也难以将待测原子转为无机形式，必须用有机破坏的方法将药物结构破坏完全，方能选用合适的分析方法进行测定。,（一）湿法破坏酸消解法,本法适用于含氮有机合成药物分析的前处理，在生物制品分析中用于氮（包括蛋白质）、磷、硫柳汞及氯化钠测定法的前处理。另外，本法亦用于生物样品中金属元素测定时生物基质的去除。,本法主要使用硫酸作为分解剂(消解剂或消化剂)，常加入氧化剂(如硝酸、高氯酸、过氧化氢等)作为辅助分解剂。,1.硝酸-高氯酸法本法适用于血、尿、组织等生物样品的破坏，有机金属药物经破坏后，得到的无机金属离子一般呈高价态。本法不能用于含氮杂环药物的破坏。,2.硝酸-硫酸法本法适用于大多数有机物质的破坏，破坏得到的无机金属离子均为高价态。本法不能用于含碱土金属有机药物的破坏。,3.硫酸-硫酸盐法本法是往样品中加入浓硫酸作氧化剂，加入硫酸盐提高硫酸的沸点，增强硫酸的氧化破坏能力，且防止硫酸的分解损失。本法常用于含砷或锑有机药物的破坏，破坏得到的无机金属离子多为低价态。,4.其它湿法硝酸硫酸高氯酸法；硫酸氧化剂法（过氧化氢法、高锰酸钾）。破坏后，金属呈高价态。,5.凯氏定氮法氮测定法,应用于测定含有氨基或酰胺结构的药物含量。,原理:有机含氮化合物与硫酸共热，药物分子中有机结构被氧化分解，有机结合的氮转变成氨，并与硫酸结合成为硫酸氢铵及硫酸铵，用氢氧化钠碱化后，释放出氨气，随水蒸气馏出，用硼酸溶液或定量的酸吸收后，用酸滴定液或碱滴定液滴定，并将滴定结果用空白试验校正。根据与氨作用的酸量计算供试品中氮的含量或换算为被测药物的含量。,（二）干法破坏,1.高温炽灼法本法系将含待测元素的有机药物经高温灼烧灰化，使有机结构分解而待测元素转化为无机元素或可溶性无机盐，以供分析。,样品,无水碳酸钠或轻质氧化镁,坩埚,混合均匀,小火加热,炭化,高温灼烧,灰化,注意事项：（1）加热或灼烧时，应控制温度在420以下；（2）一定要灰化完全；（3）经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，可经加热煮沸使溶解,2.氧瓶燃烧分解后测定,氧瓶燃烧法：本法是将分子中含有卤素或硫等元素的有机药物在充满氧气的密闭燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧产物吸收于适当的吸收液中，再采用适宜的分析方法来检查或测定卤素或硫等元素的含量。,适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析。,燃烧氧瓶：由硬质玻璃制成的无色、磨口、厚壁锥形瓶。瓶塞空心，底部熔封铂丝一根，下端呈螺旋状或网状。,（1）仪器装置,铂丝燃烧时起催化作用。,燃烧瓶大小的选择,正确选用燃烧瓶的目的在于：样品能在足够的氧气中燃烧分解完全；有利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸收液中；防止爆炸的可能。测定含氟有机药物时，用石英制燃烧瓶。,（2）燃烧分解操作,用洗液洗净后，按各药品项下的规定加入吸收液，并将瓶口用水湿润小心急速地通入氧气1min，立即用表面皿覆盖瓶口。,a.燃烧瓶燃烧前的准备,吸收液：吸收液的作用是将样品经燃烧分解所产生的各种价态的卤素、硫、氮、硒等，定量地吸收并转变为一定的便于测定的价态。,吸收液的选择：,氟：水氯：NaOH溶液溴：H2O2-NaOH或NaOH-硫酸肼饱和溶液碘：NaOH硫酸肼饱和溶液硫：NaOH或H2O2硒：硝酸溶液,b.样品的准备,取样品适量，精密称定后按规定方法包裹，固定于铂丝下端的网内或螺旋处。,软膏类：包裹在不含被测成分的蜡油纸中，再用无灰滤纸将蜡油纸包包裹在里边,液体样品：装于用透明胶纸和无灰滤纸做成的纸袋,固体样品：用剪裁成一定形状的无灰滤纸包裹,c.样品的燃烧,点燃滤纸包尾部，迅速放入燃烧瓶中，按紧瓶塞，加水少量封闭瓶口，燃烧完毕（应无黑色碎片），充分振摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液，放置15min，用水少量冲洗瓶塞及铂丝，合并洗液及吸收液，同法另做空白试验。按各药品项下规定的方法进行检查或测定。,（3）注意事项,燃烧瓶要洗净,不得残留有机溶剂；应选择气密性好及与样品量相适宜的燃烧瓶。,燃烧完全应注意：氧气要充足；样品要干燥。,燃烧烟雾应完全吸收。,应同时做空白实验。,取本品约20mg，精密称定，照氧瓶燃烧法进行有机破坏，用氢氧化钠试液2ml与水10ml为吸收液，待吸收完全后，加溴醋酸溶液(取醋酸钾10g，加冰醋酸适量使溶解，加溴0.4ml，再加冰醋酸使成100m1)l0ml，密塞，振摇，放置数分钟，加甲酸约lml，用水洗涤瓶口，并通入空气流约35min以除去剩余的溴蒸气，加碘化钾2g，密塞，摇匀，用硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每lml的硫代硫酸钠滴定液(0.02mol/L)相当于1.388mg的C19H29IO2。,碘苯酯的含量测定Ch.P.（2010）,选择氧瓶燃烧法所必备的实验物品A.磨口硬质玻璃锥形瓶B.铂丝C.普通滤纸D.氢气E.无灰滤纸,氧瓶燃烧法测定含氯有机药物时所用的吸收液多数为A.H2O2溶液B.H2O2NaOH溶液C.NaOH溶液D硫酸肼饱和液E.NaOH硫酸肼饱和液,氧瓶燃烧法可用于A.含卤素有机药物的含量测定B.醚类药物的含量测定C.检查甾体激素类药物中的氟D.检查甾体激素类药物中的硒E.芳酸类药物的含量测定,第二节生物分析样品的制备,生物样品分析（体内药物分析）：是通过分析的手段研究药物在体内数量与质量的变化，以获得各种药物动力学参数及其转化、代谢的方式与途径等信息。从而有助于药物的生产、实验研究、临床等环节对所研究的药物作出估计与评价，以及对药物的改进与发展作出贡献。,生物样品分析特点：,1.样品成分复杂，干扰物质多，存在形式多样，大多需经过分离、纯化后才能进行测定预处理。,生物样品的介质组成比较复杂，包括有高分子蛋白质和低分子糖、脂肪、尿素等有机物，Na+、K+、X-等无机物等。体内药物存在形式：游离型（原型药物、代谢物）;药物与蛋白质的结合物；缀合物（药物经代谢后，极性增强，与内源性物质结合生成缀合物）。,2.样品量少，且多数需在特定条件下采集，不易重新获得细心操作。3.被测药物及其代谢物的浓度或活性较低，对分析方法的灵敏度有较高要求灵敏度高。4.数据重现性较差误差大。5.方法在不断发展与完善中创新。,一、生物样品的种类与制备,1.应根据不同的分析目的与要求进行选取；2.所取样品应能够正确反映药物浓度与效应之间的关系；3.样品应易于获得，便于处理、分析。,选取样品的原则：,（一）血样,包括血浆、血清与全血，常用的为血浆和血清。,1.取血方式分布均匀后取样,动脉血、心脏取血（动物）静脉采血毛细管采血,2.血样的制备,3.血样的主要成分区别,血浆比血清分离快，制取的量多，样品纯化较容易；而且大多数药物在体内达到稳定状态时，其在血浆中的浓度与作用点的浓度密切相关，可以作为在作用部位药物浓度的可靠指标。为最常用的血样。,血清成分最接近组织液化学成分，最能反应机体的具体情况；但获取量小。,全血的净化较麻烦，尤其是溶血后，血色素会给测定带来干扰，只在个别情况使用。,4.血样的保存,血样采集后应及时分离血浆或血清，最好马上分析；,短期保存时应置于冰箱冷藏室（4）中;,长期保存时应置于冰箱冷冻室（-20）中。,（二）尿液,测定尿中药物浓度时应采用时间尿，即将一定时间内（如8h、12h或24h等）排泄的尿液全部储存起来，并记录其体积，取一部分测定药物浓度，然后乘以尿量求得排泄总量。,1.采集,2.保存,采集后应立即测定,不能立即测定时，加入防腐剂（如甲苯、氯仿、浓盐酸等）置冰箱中保存,保存时间为2436h，可置冰箱冷藏室（4）中，长时间保存时，应冷冻（-20）,3.特点,体内药物的清除主要是通过尿液排出，药物可以原型（母体药物）或代谢物及其缀合物等形式排出。,尿药测定主要用于药物剂量回收研究，尿清除率、生物利用度的研究，或药物代谢类型的确定。,优：药物浓度高，收集方便,缺：浓度随时间变化大；与血药浓度相关性差；受患者肾功能影响大；尿液不易采集完全且不易保存,（三）组织样品,测定之前首先进行匀浆化，取采集的组织样品，加入一定量的水或缓冲液，于匀浆机中匀浆化处理，制成一定浓度的水基质匀浆液，制备或低温贮藏。,1.采集,2.制备,（四）毛发样品,取枕后部，采集距头皮1cm以上的头发约0.51g。,1.采集,充分洗净后，有机破坏。,2.制备,二、生物样品分析前处理技术,应根据生物样品的种类、被测药物理化性质、浓度范围、存在形式、测定方法采取相应的分析方法，从而确定合适的前处理方法。,（一）蛋白质去除,1.目的,使结合型药物释放出来预防提取过程中蛋白质的干扰保护仪器性能，延长使用期限,2.方法,（1）加入与水相混溶的有机溶剂,水溶性的有机溶剂可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，释放出与蛋白结合的药物。,常用有机溶剂：乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、丙醇、四氢呋喃。,（2）加入中性盐,中性盐的加入将与蛋白质水合的水置换出来，使蛋白质脱水而沉淀。,常用中性盐：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐。,（3）加入强酸,当pH低于蛋白质的等当点时，蛋白质以阳离子形式存在，加入强酸后，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀。,常用强酸：10%三氯醋酸、6%高氯酸、硫酸-钨酸混合液及5%偏磷酸。,注意：,1.经过强酸处理后上清液pH为04，不适于在酸性条件下分解的药物。,2.为避免对下一步测定的干扰，过量的强酸要除去。,（4）加入含锌盐及铜盐的沉淀剂,当pH高于蛋白质的等当点时，金属阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。,常用的沉淀剂：CuSO4-NaWO4、ZnSO4-NaOH,将有机溶剂（强酸、中性盐、金属阳离子沉淀剂）与血样按一定比例混合后置具塞塑料尖底管中，用超速离心机（10000rpm）离心12min，取上清液即可。,操作：,（5）酶解法,蛋白水解酶在碱性条件下降解蛋白质的肽键，使药物析出。适用于测定蛋白结合牢固的药物，不适用于在碱性下易水解的药物。,常用蛋白水解酶：枯草菌溶素,（6）加热法,待测药物对热稳定时，可采用加热的方法使蛋白质凝固沉淀，并释放出与之结合的药物。本法只能除去热变性蛋白质。,（二）缀合物的水解,尿中的药物多为缀