质粒提取、定量与酶切鉴定.ppt

质粒DNA的提取、定量和酶切鉴定，质粒DNA的提取和鉴定，实验流程图，第一，碱裂解法提取质粒，第三，质粒酶切，第二，质粒定量，第四，酶切产物的琼脂糖电泳检测，最后，掌握碱裂解法提取质粒，掌握紫外吸收法测定DNA，了解质粒消化和鉴定的原理，掌握琼脂糖凝胶电泳技术，实验目的，实验材料， 大肠杆菌DH5a株pMD18-T载体易质粒微量提取试剂盒、TakaraEcoRI限制性内切酶TakaraHindIII限制性内切酶Takara10M酶消化缓冲液、BioWest电泳琼脂糖干粉0.5TBE核酸电泳缓冲液EB核酸荧光染料Takara6电泳加载缓冲液、实验仪器、微量移液器离心恒温水浴箱紫外检测器电泳仪卧式电泳槽、独立细菌染色体、能独立自主复制闭环DNA分子基因工程常用载体、一、碱性裂解法提取质粒DNA、碱性裂解法； 沸腾和裂解；羟基磷灰石柱色谱；质粒脱氧核糖核酸释放法；酸性苯酚法等。质粒提取方法：碱性裂解法的基本原理，是根据染色体DNA和质粒DNA变性和复性的不同来达到分离的目的。染色体DNA:氢键断裂，变性。质粒DNA:大多数氢键被破坏，但是超螺旋共价闭合环的两条互补链不会完全分离。(不完全变性)，质粒DNA:复性，染色体DNA溶于溶液：不可复性；形成一个错综复杂的网络结构。pH=12.6(碱性)，NaAc溶液(pH4.8)，pH=中性，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀。离心，pMD18-T，溶液S1(细菌悬液)溶解产物S2中和溶液S3洗涤溶液W洗脱液核糖核酸吸附柱(100毫克/毫升)，试剂盒组成：溶液S1:50毫升/升葡萄糖10毫摩尔/勒达25毫摩尔/升盐酸(ph 8.0) 2毫克/毫升溶菌酶溶解产物S2: 200毫摩尔/升氢氧化钠1%十二烷基硫酸钠中和溶液S3:3毫升/毫升AAC (ph 4.8)溶液，1，取1.5毫升培养物并将其加入到Eppendorf中2.加入250l溶液S1，涡旋振荡，使细菌沉淀分散，完全悬浮。3.加入250l S2裂解液，倒置4 6次，均匀3分钟(不要剧烈振荡)，室温放置3分钟(不超过5分钟)。4.加入350l中和溶液S3，立即轻轻反转6-8次，混合直至出现白色絮状沉淀。5、室温下以12000rpm离心10分钟。6.小心取上清液，每次以600l转移至吸附柱(带收集管)，在室温12000rpm离心30s，弃去滤液，将吸附柱放回收集管。7.向吸附柱中加入600l洗涤液W，以12000rpm离心30s，弃去滤液。8.重复步骤7一次。9.以10000转/分的速度离心空柱2分钟。10.取出吸附柱，置于干净的离心管中，在吸附膜中间加入50L 56的预热洗脱液，室温放置1分钟，12000转/分钟离心1分钟，收集洗脱液(即纯化的质粒DNA)，在-20保存备用。，实验过程，1.5毫升菌液，12000转/分钟，1分钟，细菌沉淀，溶液S1，250l，剧烈摇动，裂解溶液S2，250l，反向混合4-6次，中和溶液S3，350l，轻轻反向混合6-8次，12000转/分钟，10分钟，室温下静置3-5分钟，直至出现白色絮状沉淀，取600l上清液至吸附柱管12000转/分钟，12， 预热至50l56，12，000 rpm 1分钟，室温放置1分钟，弃去空柱滤液，收集洗脱液备用、洗涤液w，600 l，弃去滤液，弃去滤液，2。 悬浮细胞，1。收集细胞，3。溶解细胞，4。中和，6。洗涤柱，7。洗脱，5。通过柱分离，加入洗脱液，加入洗涤液W，2。质粒DNA的定量测定。利用核酸在260纳米处吸收的特点，基本原理，紫外分光光度计，操作步骤，取2 L提取的质粒DNA，加入98l蒸馏水，混合均匀3。用紫外分光光度计测量A260。脱氧核糖核酸或核糖核酸的定量A260=1.0相当于50微克/毫升双链脱氧核糖核酸40微克/毫升单链脱氧核糖核酸(或核糖核酸)20微克/毫升寡核苷酸。紫外吸收法：脱氧核糖核酸纯度： od260/OD280=1.8核糖核酸纯度： od260/od280=2.0，脱氧核糖核酸或核糖核酸纯度测定，iii。质粒DNA的酶切分析，质粒DNA:3kb载体：pMD18-T2.7kb基因：CHD50.4kb，限制性内切酶特异性结合到特定的位点内或附近的特定的DNA序列称为限制性内切酶识别序列，并且双链DNA在此被切割。第二类限制性内切酶通常用于分子克隆，其识别位点是长度为4-6个核苷酸的反向重复序列。限制性内切酶、EcoR和Hind的识别序列和切口为：ECOR:gLeft AATTCHIND:aLeft AGC TT，PMD 18-T，将下列反应物在0.5毫升的离心管中混合均匀：混合后，将下列反应物在37水浴中洗涤1 2小时，质粒DNA的酶切分析操作，1，2，3，4，影响酶切反应的因素，底物DNA反应体系的纯度：(反应缓冲液)反应体积：甘油琼脂糖凝胶电泳，电泳：带电粒子在电场中游动的现象，影响迁移率的因素？电场，样品：大小(分子量)形状(构型)电荷，共价闭环超螺旋DNA 线性DNA 开环双链环状DNA，质粒DNA三种构型：共价闭环超螺旋线性开环双链环状，琼脂糖凝胶，琼脂糖(琼脂糖)是一种多糖，由半乳糖及其衍生物组成的中性物质，不带电荷。琼脂糖是透明的，没有紫外线吸收。因此，琼脂糖通常用作平板电泳的电泳支持物。本电泳使用1.0%琼脂糖凝胶，琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围，琼脂糖凝胶的制备和装载：在装载前，样品与6个装载缓冲液混合，电泳：电压100伏；结果观察30分钟：凝胶成像仪，琼脂糖凝胶电泳操作，琼脂糖凝胶电泳，1。凝胶制备称取1g琼脂糖，置于三角瓶中，加入0.5-100毫升；(2)微波炉加热约2分钟以熔化琼脂糖；2.胶床的准备将梳子垂直插入胶床的小槽中，梳齿底部与床面之间留有1毫米的间隙；(2)将胶床放在调整好的水平台上；涂胶：将冷却至60的凝胶倒入准备好的胶层中，凝胶厚度约为5毫米；让凝胶在室温下静置固化。将装有凝胶的凝胶床放置在电泳槽中，将样品孔定位在电场的负极；向电泳槽中加入0.5倍的电泳缓冲液，穿过凝胶表面；轻轻拔出固定在凝胶中的梳子；样品制备：向核酸样品中加入约1/6样品体积的样品加载缓冲液，并用样品加料器轻轻混合；进样：用进样器吸取样品，轻轻加入凝胶样品孔，进样量为6L；盖上电泳槽，打开电源，开始电泳。电泳条件：电压80v；时间为25-30分钟；电泳后，切断电源，取出凝胶。电泳分析琼脂糖凝胶电泳加载，1: DNA标记(5L) 2:提取的质粒DNA (5L) 3:质粒DNA酶消化产物(10l)，每组2个样品，DNA标记(梯形)，加载缓冲液加载缓冲液，EDTA甘油.提高溶液密度溴酚蓝.二甲基苯胺蓝指示剂.指示剂，成分，在0.5倍体积比，0.5-1.4%的胶中，迁移率溴酚蓝=300bp二甲基苯胺蓝=4kbp，溴化乙二胺(EB):3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶可插入到DNA分子碱基对之间并与之结合，在紫外照射