琼脂扩散实验ppt课件

实验2、马立克氏病琼脂扩散实验1、鸡马立克氏病是鸡马立克氏病病毒(MDV )所致的鸡肿瘤性传染病。 临床以消瘦、麻木、皮肤及内脏出现肿瘤为主要特点。 造成严重的经济损失，是世界养鸡业的主要疾病之一。 鸡马立克病交叉姿势2、流行病学临床症状病理组织学检测病毒分离检测血清学试验：琼脂扩散试验(OIE推荐的替代试验方法)、马立克病诊断的主要依据酶联免疫吸附试验、AGP可应用于20日龄以上的马立克病鸡羽髓抗原检测和1月龄以上的鸡血清抗体检测。 3、目的：了解琼脂扩散试验疾病诊断的操作和结果判定方法的仪器和材料：琼脂穿孔器、微量移液管或带乳头吸管、平盘等。 试剂：马立克氏病标准抗原，标准阳性血清和标准阴性血清。 利用实验类型的单向单扩散、单向单扩散、双向单扩散、双向双扩散、实验目的、类型、仪器和材料、4、可溶性抗原和抗体在半固体凝胶中进行相对扩散反应，抗原抗体分子相遇达到适当比例时，相互结合凝聚，在两孔间比例最佳的位置出现白色沉淀带，判定相应的抗体和抗原。 可用于20日龄以上马立克氏病鸡羽髓抗原检测和1月龄以上鸡血清抗体检测。 实验原理、5、实验原理、琼脂糖的疏散网状结构有利于大分子的自由移动，结合适当比例的抗原抗体后凝聚形成沉淀，形成阻止抗原抗体复合体自由运动的沉淀带，如特异性阻挡物，持续扩散的相同抗原抗体只是沉淀带变厚，除此以外6、沉淀线的特征和位置： 1抗原，抗体特异性和浓度2抗原，抗体分子大小3扩散率，实验原理，7，a .抗原抗体浓度基本平衡时，该沉淀带的位置主要取决于两者的扩散系数。 b .抗原过多时沉淀带向抗体转移，反之亦然。 实验原理，8，实验原理，c .9，1 %琼脂粉，0.01MPBS，封底，1/万硫柳汞，水浴加热熔融，琼脂平板制备，10，鸡群马克病感染情况监测通常采用琼脂扩散试验，检测对象包括血清中马克病病毒特异抗体或鸡羽髓中马克病病毒抗原。 其操作方法为：1.琼脂糖板制备以0.01MpH7.4的PBS制备1%琼脂糖溶液，水浴的加温充分溶解后，加入培养皿，制作厚度约23mm的琼脂糖凝胶板、实验步骤11、2 .检测血清抗体时，向中央孔滴加马氏病病毒标准约翰抗原，向周边孔滴加检查对象血清，但至少向一个孔滴加阳性血清，抗原和血清的添加量不满足，不能满足程度。 加入样品后，盖上琼脂盘，放入盖好的湿箱中，在37的烘箱中孵育824h小时，观察结果并记录下来。 测定抗体效价时，将血清以倍比稀释，将沉淀带出现的血清的最大稀释度作为抗体效价。实验步骤12、3 .检测抗原时，向中央孔加马里氏病标准阳性血清、周边1、4孔加马里氏病标准抗原、周边2、3、5、6孔加待羽髓液浸，即试管内加入12滴PBS缩小羽髓。 样品后将寒天平皿放入湿盒中，用37的烤箱孵育，824h小时内观察结果。 实验步骤，13，1，不要激烈振动溶解的琼脂糖，防止气泡的产生。 2、反应时间适当，时间过长，沉淀线离解成假阴性，不出现，不清楚。 3 .放入样品时，请注意不要产生气泡，以便装满。 4、每次加入不同样品都要更换枪头，以免受污染。注意事项，14，抗原检测，羽髓抗原检测，2，3，5，6孔分别加倍比稀释的被检测羽髓液浸，检测被检测血清，15孔分别加倍比稀释的被检测力值的血清，6孔加PBS，抗体检测，15，在被检测试样孔和中心孔之间形成清晰的沉淀线， 与周边已知抗原孔的沉淀线融合时判定为阳性的没有出现沉淀线的人判定为阴性的结果，16、发现抗原和阳性血清之间产生的沉淀线的末端向被测试样孔的内侧弯曲时，该被测试样被判定为弱阳性。 结果表明，Ag、Ab、检测对象血清、17、被检测材料中可能出现2条以上沉淀线，其中1条与已知抗原和阳性血清沉淀线融合者为阳性。 抗原中存在多种成分时，会出现多条沉淀线或交叉反应线，因此检测抗原与免疫血清的特异性、纯度或浓度，比较抗原之间的异同点，应用范围