人参皂苷的提取

第一章概述1.1人参皂苷介绍人参是五加科植物人参的干燥根，是一种传统的珍贵中药。它首先发表在中国的第一部草药专论神农本草经中。它的栽培者被称为“花园人参”，而野生的被称为“山参”。人参具有补元气、复脉、健脾、益肺、生津、安神的功效。可用于治疗体虚、肢体冷脉、脾虚、缺粮、肺虚、哮喘、咳嗽、津伤、口渴、内热、糖尿病、慢性病、乏力、心悸、失眠、阳痿、宫寒、心力衰竭、心源性休克等。人参的化学成分非常复杂，包括皂甙、挥发油、糖和维生素。现代医学和药理学研究证明，人参皂苷是人参的主要活性成分，具有人参的主要生理活性。人参皂苷是人参的主要活性成分，已确认的人参皂苷单体约有40种。人参中的含量约为4%。其中，Rg3和Rh2研究最多，与肿瘤细胞凋亡关系最密切。许多研究表明，它具有很高的抗肿瘤活性，对正常细胞无毒副作用，并与其他化疗药物(如顺铂)有协同作用。人参皂苷通过调节肿瘤细胞的增殖周期、诱导细胞分化和凋亡而发挥抗肿瘤作用。诱导肿瘤细胞分化为正常细胞有利于控制肿瘤的发展，在细胞分裂后诱导肿瘤细胞凋亡形成凋亡小体，并且不会引起周围组织的炎症反应。Popovich等人认为人参皂苷可以通过地塞米松已知的受体依赖性途径促进人类白血病细胞的凋亡。目前，我国对人参皂苷的提取分离方法、制备技术、抗肿瘤机制和临床应用进行了大量研究，人参皂苷新产品已经投放市场。1.2人参皂苷成分人参的根、茎、叶、花和果实都含有各种人参皂苷。迄今为止，文献报道从人参根和其它部位分离得到的具有化学结构的人参皂苷包括50多种人参皂苷，如人参皂苷-R0，-Ra1，-Ra2，-Rb1，-Rb2，-Rb3，-Rc，-Rd，-Re，-Rf，-Rg1，-Rg2，-Rg3，-Rh1，-Rh2和-Rh3。Rh2:具有抑制癌细胞向其他器官转移、增强机体免疫力、快速恢复体质的作用。对癌细胞有明显的抗转移作用，可与手术配合使用，促进伤口愈合和术后体力恢复。Rg:具有兴奋中枢神经、抗疲劳、改善记忆和学习能力、促进DNA和RNA合成的功能。Rg1:能缓解疲劳，改善学习记忆，延缓衰老，兴奋中枢神经系统，抑制血小板聚集。Rg2:具有抗休克作用，能迅速改善心肌缺血和缺氧，治疗和预防冠心病。Rg3:作用于细胞生殖周期的G2期，抑制癌细胞有丝分裂前期蛋白质和三磷酸腺苷的合成，减缓癌细胞的增殖和生长，具有抑制癌细胞浸润、抗肿瘤细胞转移、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长等作用。Rb1:西洋参(西洋参)含量最高，有可能影响动物睾丸，也影响小鼠胚胎发育，具有增强胆碱系统、增加乙酰胆碱合成和释放、改善记忆的功能。RB2:促进脱氧核糖核酸和核糖核酸的合成，并调节大脑中心。具有抑制中枢神经、降低细胞内钙、抗氧化、清除体内自由基、改善心肌缺血再灌注损伤的作用。人参皂苷Rc:人参皂苷Rc是人参中的甾醇分子。它具有抑制癌细胞的功能。可以增加精子的活力。Rb3:能增强心肌功能，保护人体免疫系统。可用于治疗各种原因引起的心肌收缩衰竭。Rh:具有抑制中枢神经、催眠、镇痛、镇静、解热和促进血清蛋白合成的作用。Rh1:具有促进肝细胞增殖和DNA合成的作用，可用于治疗和预防肝炎和肝硬化。罗：有消炎，排毒人参可以调节中枢神经系统兴奋和抑制之间的平衡。通过研究人参对动物脑电活动的影响，结果表明人参对两种神经过程都有兴奋和抑制作用，但主要是加强大脑皮层的兴奋过程。由于它同时作用于抑制过程，抑制趋向于集中，并且分化加速并且更完全。人参可以调节神经功能，恢复神经紊乱引起的神经过程。人参皂苷Rb具有中枢镇静作用，Rb1、Rb2和Rc混合皂苷具有稳定作用。Rg具有中枢兴奋作用。人参皂苷对中枢神经系统的作用是小剂量兴奋和大剂量抑制。腹腔注射5g/kg人参水提取物可明显降低小鼠的自发活动。人参水浸还能抗可卡因、士的宁和戊四氮引起的惊厥，并能降低惊厥的死亡率。有报道指出，人参粗中性皂苷不仅具有镇静安神的作用，还具有镇痛、肌肉松弛和清凉的作用。人参对学习和记忆的影响是双向的和成分依赖的。在大鼠的Y-迷宫实验中，连续3天口服人参提取物20毫克/千克有助于30分钟的学习和24小时的记忆保持。然而，当剂量增加到100毫克/千克时，学习和记忆没有改善，但一些学习和记忆指标受到损害。人参提取物可防止应激引起的小鼠学习能力下降。有报道称人参提取物对樟柳碱和戊巴比妥钠引起的记忆障碍有拮抗作用，还能改善环己酰亚胺和亚硝酸钠引起的记忆巩固障碍和40%乙醇引起的记忆再生障碍。小鼠腹腔注射人参皂苷200毫克/千克、100毫克/千克和50毫克/千克，可明显对抗樟柳碱的作用，改善小鼠记忆，增加脑内核糖核酸，但对脱氧核糖核酸和蛋白质含量无明显影响。人体实验证明，人参可以提高工作能力和减少疲劳，这被认为是其兴奋中心的结果。其作用强度超过安非他明，但没有安非他明的缺点。服用人参可以提高思维能力和劳动效率。动物实验表明，人参能显著延长小鼠的游泳时间。首先，用各种方法使小鼠筋疲力尽，然后服用人参以证明人参能明显加速其体力的恢复并增加其运动能力。人参能减轻兴奋过程中的疲劳，表现为增强神经兴奋过程的灵活性，降低神经疲劳程度，从而消除各种虚弱症状，显示抗疲劳作用。也有报道称，人参抗疲劳作用的机制可能与增加血脂、促进蛋白质和核糖核酸合成有关。人参中含有的各种皂苷、人参多糖和人参挥发油具有抗肿瘤作用。红参中的人参皂苷可以再分化癌细胞并诱导其向非癌细胞的逆转。人参茎叶总皂苷能抑制体外培养的人胃癌细胞的生长速度和分裂能力，增加细胞内糖原的含量，降低细胞内粘多糖和酸性磷酸酶的活性，对抑制胃癌细胞的生长和增殖有一定作用。人参花皂苷和叶乙二醇组在体外也有一定的抗肿瘤作用。人参地上挥发油成分可减少体外培养的胃癌和肝癌细胞的数量，抑制其生长，增加死亡癌细胞的数量。长期口服红参提取物可降低氨基甲酸乙酯、N-甲基-N-亚硝基-N-硝基胍、黄曲霉毒素和其他化学品对小鼠和大鼠的致癌作用。长期口服朝鲜红参粉可降低接触致癌物如二甲基甲酰胺、氨基甲酸乙酯、AFF、MNNG和黄曲霉毒素的动物的肿瘤发病率，并抑制其生长。人参皂苷对小鼠肉瘤S180有抑制作用。实验表明，人参能明显减缓癌前病变或早期癌症的发展，保护癌旁肝组织，尤其是线粒体、内质网等亚显微结构，减少癌前病变的发生，从而明显延长癌症小鼠的生存时间。体外试验人参皂苷具有多种抗吗啡耐受和成瘾作用。肝脏中有一个吗啡6-脱氢酶，它催化吗啡转化为吗啡酮。人参皂苷能抑制吗啡6-脱氢酶，有效阻断吗啡酮的生成，提高肝脏谷胱甘肽水平，解除吗啡对脑内神经递质释放的抑制，防止吗啡耐受和成瘾，缓解戒断症状，疗效显著。同时，它对吗啡的镇痛作用没有影响。不同浓度的人参提取物浓缩物对福氏志贺氏菌、溶血性链球菌B和紫色青霉有抑制作用。较高浓度可抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、炭疽杆菌、肺炎球菌、黑曲霉和产黄青霉。茎和叶中的人参皂苷对单纯疱疹病毒感染细胞有保护作用。实验证明人参茎叶总皂苷对细胞的保护作用主要是明显抑制病毒复制，而不是直接杀死病毒。人参提取物对感染森林病毒的动物具有保护作用，并具有增强干扰素诱导的抗病毒能力。人参碱溶性多糖组分对盐酸/乙醇诱导的胃粘膜损伤有明显的抑制作用，抑制率分别为57.3%和74.2%。如果预先给予吲哚美辛，多糖对胃粘膜的保护作用不会消失。人参皂苷可促进大鼠和猴肾皮质细胞的DNA合成，促进肾脏的代偿性生长。实验表明，在临床上随机增加人参的用量可能达不到相应提高疗效的目的。1.4三种人参皂苷根据皂苷元的结构，可分为三种类型：人参二醇-A型，人参三醇-B型，齐墩果酸-C型。A型和B型皂苷均属于四环三萜皂苷，其皂苷元为达玛烷型四环三萜。A型皂甙元被称为20(S)-原人参二醇20(S)-原人参二醇。B型皂苷元被称为20(S)-原人参三醇20(S)-原人参三醇。C型皂苷是齐墩果烷型五环三萜的衍生物，其皂苷元是齐墩果酸。第二章人参皂苷的提取及苷的分离鉴定实验2.1目的要求通过实验掌握人参皂苷的提取和精制方法，进一步巩固和熟悉人参皂苷的性质。(2)熟悉和掌握人参皂苷的水解条件和方法。(3)熟悉和掌握柱层析分离人参皂苷的原理和方法以及基本操作技术。2.2人参中人参皂苷的提取及人参皂苷的分离与鉴定1.原理：人参皂苷与多分子糖结合形成糖苷，该糖苷高度亲水，可溶于水和低级醇。实验室使用热水提取人参皂苷，并在提取物中加入碱(CaO)以去除杂质。用酸调至中性，置于大孔树脂柱上，用水洗涤除去色素至无色，然后用70%氨水醇洗涤至无色，然后将人参皂苷溶于乙醇中洗脱，回收乙醇，得到人参总皂苷。人参皂苷和稀盐酸在醇溶液中进行温和酸水解，得到三种皂苷元，齐墩果酸、人参二醇和人参三醇。然而，不能获得原人参二醇和原人参三醇，因为侧链20位碳原子上的羟基(-OH)和链上的双键(C=C)在酸水解过程中容易闭合，形成具有三甲基四氢吡喃环的人参二醇和人参三醇。水解后，除去乙醇和氯仿提取物，用硅胶柱色谱分离，得到三种单体皂甙元，再重结晶，得到纯产物，分别与已知皂甙的红外光谱一致。2.人参皂苷提取及苷元分离工艺流程(1)人参皂苷提取工艺：人参茎叶粗粉20克热水提取1小时，粗过滤，(棉)提取残渣加入0.6g牛奶沉淀，调节ph至9-10，静置10分钟，过滤沉淀物滤液将浓硫酸调节至PH7并静置10分钟。中性提取物回收后，用大孔树脂柱，用水洗涤至无色，然后使用70%氨水醇洗至绿色。乙醇洗脱液正在恢复eth(酸性皂苷元部分)用水稀释，水浴蒸去乙醇，用氯仿提取3次(10，5，5毫升)含水氯仿层干燥无水NaSO，氯仿的回收总皂苷元溶解少量苯，硅胶柱色谱法，使用苯-乙酸乙酯(8: 2)洗脱构成部分一、构成部分二、构成部分三95%乙醇重量95%乙醇重量丙酮结晶结晶3次结晶3次结晶2次齐墩果酸人参二醇人参三醇mp299-301mp245-250mp244-2461.操作方法(1)人参总皂苷的提取：取人参茎叶粗粉20克，放入烧杯中，用热水(80-90 )提取1小时，然后用棉花粗滤，向所得滤液中加入0.6克石灰乳除去杂质，调节ph值至9-10，约10分钟，过滤，然后用浓硫酸(少量)调节滤液至PH7，约10分钟， 至少回收一定量(5-10毫升)的提取液，然后加入大孔树脂柱(注意：该柱应提前清洗好，清洗方法是少量的)，首先用蒸馏水洗涤至无色，然后用70%乙醇洗涤至无色约10分钟，得到乙醇洗脱液，回收乙醇，得到人参总皂苷(黄色和白色)。(2)人参皂苷的水解称取人参皂苷4-5g(不足时由老师提供)，加入20倍的含5%盐酸的50%乙醇溶液，加热回流2小时，冷却，加入0.5倍的水，水浴除去乙醇，转移至分液漏斗，用氯仿萃取3次(10，5，5ml)，合并氯仿层，加入少量无水硫酸钠干燥，回收氯仿，得总皂苷元。(3)柱色谱法分离苷元称取50g 100-200目的硅胶(在105下活化30分钟)，用苯作为洗脱剂湿装色谱柱，在色谱柱顶部放置一层脱脂棉，压上几个玻璃球，释放过量的苯(在吸附剂上方1厘米处)，并计算保留体积。用少量苯溶解总皂苷元，用苯-乙酸乙酯(8: 2)洗脱，合并薄层鉴别的相同组分(与皂苷元标准品相比)，回收溶剂。齐墩果酸和人参二醇在95%乙醇中重结晶，人参三醇在丙酮中重结晶，纯品在80干燥，收集于小瓶中。注：由于人参花和叶中人参皂苷含量高且价格便宜，因此人参地上部分可作为本实验的原料，脱脂可进行3-4次，由绿色变为棕色，其他操作与之前相同。如果人参根中的人参总皂苷用于柱层析，学生需要精制人参二醇用于红外光谱鉴定。如果人参花和叶总皂苷用于柱色谱分离，学生需要精制人参三醇进行红外光谱鉴定。2.3人参皂苷的鉴定(a)颜色反应1.乙酸酐-浓硫酸反应(Libermamm-Burchand反应)取少量人参皂苷样品，溶于冰醋酸中，加入几滴乙酸酐-浓硫酸试剂(19: 1)，混合均匀，呈紫红色。2.泡沫反应：取少量人参皂苷样品于试管中，加入2-3毫升水溶解，塞紧，用力摇动1分钟，产生大量持久的泡沫。(2)薄层色谱1.人参皂苷薄层色谱：吸附剂：硅胶g板显影