功能性高分子聚氨基酸生物制备

功能性高分子聚氨基酸生物制备 摘要：聚氨基酸共聚物是一类新型生物降解高分子材料。聚氨基酸共聚物作为一种新型生物降解高分子材料具有许多优点。随着其应用领域的不 断拓展, 必将有力地促进这类材料在生物领域 各个方面的应用。 关键词：聚氨基酸，-聚谷氨酸，.-聚赖氨酸 聚氨基酸材料在降解过程中能够释放出天然的小分子氨基酸, 因此材料无毒, 具有良好的生物相容性, 容易被机体吸收和代谢, 是一类生物降解高分子，至今已有许多通过化学合成的聚氨 基酸被应用于食品、医药、化工等多个领域，在医学领域如药物控释、手术缝线和人工皮肤等方面具有广泛的应用。 Hoste和Giammona等人分别研究了聚谷氨酸和降解性。但是, 聚氨基酸的溶解性差别较 大, 只有少数的聚氨基酸溶于水, 大多数都是疏水性的 , 能溶于通用溶剂的也不多, 降解周期及速度很难控制, 其应用具有一定的局限性, 作为生物医用材料, 已经不能满足要求。 通过向材料中引入第二组分制备共聚物是改善高分子材料性能的重要途径之一, 通过共聚物分子量、共聚单体种类及配比等控制聚合物材料的降解速度和周期。不同结构的共聚物把不同材料的优点结合起来, 能赋予新材料特殊的性质。1.-聚谷氨酸 -聚谷氨酸Poly (-glutamic acid), -PGA是由 D-/L-谷氨酸通过 -酰胺键聚合而成的一种高分子 阴离子多肽型聚合物。生物合成的 -聚谷氨酸通常由 5005000 个谷氨酸单体组成, 分子量为 10 kD10 000 kD, 立体构型分为 -聚 D-谷 氨酸(-D-PGA)、-聚 L-谷氨酸(-L-PGA)和 -聚D/L-谷氨酸(-D/L-PGA) 3 种。-聚谷氨酸主链上含有大量游离羧基, 可发生交联、螯合、衍生化等反应, 具有强水溶性、生物相容性、生物降解性等。 随着人们环保意识日益增强, -聚谷氨酸作为可生物降解高分子材料已备受关注。1.1.-聚谷氨酸的微生物合成 -聚谷氨酸生产主要有化学合成法、提取法和 微生物发酵法 3 种。前两种方法因合成的 -聚谷氨 酸分子量低、副产物多且成本高等无法实现工业化应用。微生物法合成的 -聚谷氨酸最早于 1913 年由 Sawamura 在日本传统食品纳豆中发现。1937 年, Ivanovics 等从一种致病的革兰氏阳性细菌炭疽芽孢 杆菌的荚膜中分离到 -聚谷氨 酸。自 1942年 Bovarnick 等发现 -聚谷氨酸作为一 种发酵产物能自由地分泌到培养基中后, 人们发现多种芽孢杆菌能在胞外积累 -聚谷氨酸。上世纪 90 年代以来, 伴随 -聚谷氨酸在材料领域优越性的展 现, 国内外对 -聚谷氨酸的微生物法制备研究越发活跃, 主要集中在筛选高产野生菌株和进行菌种改 造, 以期适应工业化需求。 合成 -聚谷氨酸的微生物主要是芽孢杆菌属的细菌。最早在炭疽芽孢杆菌的荚膜中发现 的 -聚谷氨酸, 属于组成型, 能增强毒力, 配合外毒素抑制宿主的吞噬作用和逃避哺乳动 物的免疫防御系统。而适合工业化生产的菌株主要是地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌, 其合成的 -聚谷氨酸属于分泌型, 通过膜 转运到细胞外, 作为一种保护因子抵御恶劣环境, 或细菌饥饿时的营养物质。此外, Niemetz 与 Hezayen 分别发现盐碱球菌和古细 菌能在极端强碱或高盐环境下合成 -聚谷氨酸, 通过 -聚谷氨酸的强结合水能 力使菌体不致急剧失水。 1.2.-聚谷氨酸合成酶体系 多酶复合体大多通过一种非核糖体依赖方式 (硫模板机制)进行多肽的合成, 通常对氨基酸前体 具有高的立体选择性, 合成的肽段较小, 而且肽链 中的氨基酸排列非常严格。对于链极长的 -聚谷氨 酸来说, 其合成不同于硫模板机制, 采用的是一种更加独特的膜酰胺连接酶方式。 2004 年, Ashiuchi 等第一次成功分离到枯草 芽孢杆菌的细胞膜成分, 在 ATP 和 D-谷氨酸存在下体外合成了 -聚谷氨酸, 而胞质和 胞外酶成分都无法合成 -聚谷氨酸, 说明 PgsBCA 系统定位于细胞膜上; 并且没有谷氨酸消旋酶活性 或其他异构化功能, 对底物没有立体专一性。但是, D-谷氨酸依赖型的 ATP 酶活性要比 L-谷氨酸依赖型的 ATP 酶活性高, 这似乎解释了合成酶系对底物的 偏好性, 使得 -聚谷氨酸中 D-谷氨酸单体比例偏 高。另外, ATP 水解产生的是 ADP 而不是 AMP, - 聚谷氨酸合成酶作为首个膜结合酰胺连接酶系, 在 酰胺连接酶超家族中具有构象和功能的独特性。 -聚谷氨酸合成酶定位在细胞膜上, 给酶的分离纯化带来了困难。为深入研究复合酶系各成分的 作用, Ashiuchi 等通过体外转录-翻译系统合成出 酶系的 PgsB、PgsC、PgsA 3 种蛋白及蛋白的组合, 并对酶系成分的稳定性及 ATP 酶活性进行研究, 结 果发现: PgsB 和 PgsC 的结合十分紧密, 而 PgsBC 和 PgsA 的结合相对松散。结合 -聚谷氨酸合成酶基因 序列和氨基酸序列特征, 对各个成分进行了推测: PgsB 蛋白是第一个被发现的膜酰胺连接酶, 具有谷 氨酸依赖性的 ATP 水解酶特征; PgsC 的属间保守序 列是最疏水部分, 在非 -聚谷氨酸合成菌中尚无发 现, 可能与 PgsB 蛋白组成酶复合物的活性位点; PgsA 蛋白既能将酶复合体系锚定在细胞膜上, 又能 作为转运载体将 -聚谷氨酸高效地从活性中心位点 移开, 进而实现链的延长。1.3.-聚谷氨酸应用及展望 根据 -聚谷氨酸独特的理化和生物学特性, 人 们不断开发其在水凝胶、保湿剂、成膜剂、增稠剂、 分散剂、药物控释载体、基因载体、植入材 料、纳米创伤敷料、化妆品、烟草、皮革制造 工业、植物种子保护和食品添加剂等方面的应用。 -聚谷氨酸作为生物多聚物絮凝剂对饮用水、 废水处理以及食品发酵工业的下游工艺十分有用。 将经过 -射线辐射所形成的 -聚谷氨酸低度交联物与聚合氯化铝单独或复配使用, 进行了校园水体絮凝实验发现, 当两者复配使用在低浓度(各为 10 mg/L)时可达到良好的絮凝效果, 不仅降低了单独使用 -聚谷氨酸的成本, 而且减轻了铝离子对水体的污染。-聚谷氨酸交联后易形成结构稳定的水凝胶, 含水量可达 2052 倍, 对人工血液和尿液等具有很强的吸水性以及良好的温度和压力保持性。-聚谷氨酸侧链的阴离子羧基可结合带正电性 药物, 实现控释和靶向作用。研究室将水溶性较差 的抗癌药物紫杉醇和 -聚谷氨酸链 上的羧基结合, 形成稳定复合物, 被靶向运输到肿 瘤组织后释放出药物紫杉醇, 通过 EPR 效应发挥作用。Hela 细胞系培养发现, TXL 和 PGA-TXL 对细胞均有抑制 作用, 但是 PGA-TXL 效果相对更好, 主要由于 -聚 谷氨酸提高了 TXL 的溶解性。此外, -聚谷氨酸与 阳离子表面活性剂十四烷基三甲基溴化铵、 十八烷基三甲基溴化铵, 通过静电作用生成 两亲性梳型复合物 PGA-MTAB 和 PGA-STAB, 透析法包载 TXL, 观察胶束纳米粒子大小。四甲基偶氮 唑盐比色法测定了胶束的抑癌效果, 与相同 浓度的 TXL 效果类似, 但是包载的药物处于内核, 避免被巨噬细胞识别吞噬, 可运载至靶位点缓慢释 放, 提高了药物的生物利用度。 -聚谷氨酸广阔的发展前景和巨大的开发潜力是毋庸置疑的, 而亟需解决的是如何降低生产成本 和控制产物结构(L-/D-单体比例)、分子量等。 根据国内外研究现状, 认为 -聚谷氨酸的研究方向将主要集中于两大方面: 一方面继续寻求利用廉价原料高效高产的优良菌株, 特别是谷氨酸非依赖型合成菌, 并对发酵条件进行优化; 采取与谷氨酸生 产菌共混发酵法, 或者利用谷氨酸棒杆菌、烟 草叶肉细胞作为宿主实现 -聚谷氨酸合成酶表达。另一方面致力于对 -聚谷氨酸合成体系及合成 机制的探索, 通过染色体融合、基因剪接、合成酶 表面修饰、氨基酸定点突变等生物化学与分子生物 学方面深入研究, 结合基因和蛋白组数据库、计算机分析系统等, 模拟基因表达和酶系催化, 实现 - 聚谷氨酸的体外合成控制, 为大规模生产和应用起 到重要作用。2.-聚赖氨酸 -聚赖氨酸 ( - PL)就 是 一 类 由 化 学 合 成 的 聚 氨 基 酸 ,但 研 究表 明, - 聚赖氨酸在医药和食品巾应用时 ,对人体 存在着一定 的毒副作用 ,因此 ,研究开发一种天然 、无毒的聚氨摹酸成为研究的热点。 -聚 赖 氨 酸 最 早 足 由 日 本 的 Shima 和 Sakai在 门 色 链 霉 菌 的 发 酵 液 中 被 分 离得 到 的 , 并 经 过 分 析 检 测 后 发 现 其 为 一 类 有 2530 个赖氨酸单体组成 的聚合物。-聚赖氨酸不但对人 体无任何的毒副作用 ,而且它具有较强的抑菌能力。对霉菌 、酵母菌 、细菌都有明显的抑制作 用 ,且抑菌 效率高,一般在浓度大于或等于50g/mL就能起到 作用。因此 ,-聚赖氨酸被广泛应用于食品、生物 医 药等多个领域。特别是作为一种新型的食品防腐剂, 其 在 日 本 已 被 批 准 上 市 ,被 应 用 于 海 水 产 、酿 造 品 、 方便食品等的保鲜防腐。2.1 -PL产生菌株筛选 传 统 的 -PL 产 生 菌 株 筛 选 方 法 是 对 菌 株 进 行摇瓶发酵培养 ,然后检测其发酵产物。2002年 , Nishikawa和 Ogawa研 究 出 一 个 高 效 简 便 的 -PL 产 牛 菌 株 筛 选 方 法 :在 传 统 的 平 皿 中 添 加 浓 度 为 0.02%的 酸 性 染 料 PolyR一478, 通 过 PolyR一478 与 -PL 的 相 互 作 用 , 使 得 产 -PL 菌 落 周 围 的 PolyR 一-478 浓缩并产生颜色变化 ,从而鉴定出产生菌株 。目前 , Nishikawa和 Ogawa通 过 该 方 法 已 筛 选 到 大 量-PL 产 生 菌 株 , 其 中 Epichloe MN一9是 目 前 发 现 的 唯 一株 产 -PL 的 真 核 微 生 物 菌 株 。 2.2 -聚赖氨酸在食品工业中的应用2.2.1 食品防腐剂 在 工业 及 消 费 产 品 中 广 泛 应 用 的 化 学 防 腐 剂 会 危害到人体的健康 ,因此研究开发新型天然的防腐 剂是非常有意义 的。HirakilS和 Shima都发现 -PL 具有卓越的抗菌活性 和热稳定性 ,所 以是一种理想 的 天 然 食 品 防 腐 剂 。同时 N e d a 对 ,-P L 进 行 毒 理 学研究 ,经慢性和哑急性喂饲小 鼠实验证明了-PL 没 有 毒 性 , 甚 至 当 -PL 达 到 20000m g/kg 的 高 剂 量 水平的时候也不会产生任何的不利效果或基因突 变。此外 ,-PL对生殖系统 、神经系统 、免疫系统 ,以及胚胎的发育 、后代的生妊,甚至第二代的胚胎发育都会产牛毒性 ,因此是一种安全的天然 防腐剂 。 Hirakit通 过 一放 射 法 研 究 -PL 在 体 内 的 吸 收 、分 布 、代 谢 和排泄后 发 现 ,聚氨基酸共聚物作为一种新型生物降解高分子材料具有许多优点。随着其应用领域的不 断拓展, 必将有力地促进这类材料在生物领域各个方面的应用。-PL在肠 胃道 中几 乎 不 被 吸 收 ,168h 之 内 经 过 排 泄 放 射 性 也 随之削减 。 另外对受体进行 X光照射来看,在任何组织器官内 都 没 有 -PL 的 堆 积 。 -PL作 为一种新 型食 品防腐剂除了单独使用 外,还可以与其它食出添加剂混合使用,如氨基乙酸 、醋 、乙醇 、维他命等 ,并且混合使用后可以大大提高-PL的防腐能力,例如 -PI和氨基乙酸混合使用于浓缩牛奶的防腐时,会产生明显的协同增效作用 ,大大提高了抑菌能力。由于这种协同作用使得食品巾的防腐剂添加量得以减少 。 2.2.2乳化剂 虽 然-P L 被 视 为 一 种 天然 的 防 腐 剂 , 但 H i r a k i N 通过研究发现,当-PL应用到食品加工过程中会与 蛋 白质和酸性多糖互相作用 ,从而 导致抗菌活性的 降低甚至丢失 。并-PL 的 乳 化能力义较弱 ,因此限制了其 在 淀 粉 类 食品中的 应用 。-PL 与 右 旋 糖 苷 通 过 美 拉 德 反 应 后 所 得 的 产 物 会 有 较 强 的 乳 化 能 力 ,甚 至 比常用 乳 化 剂 的效 果 更好 ,并且此产物的乳化能力在 中性 pH范围内最 强 ,同 时 还 不 受 高 NaC1浓 度 (1.0mol/L)的 影 响 ,研 究 还发现所得产物 中-PL的抗菌性几乎完会被保 留。 因此可见,通过美拉德反应后 ,-PI成为了具有防腐 及乳化双重功能的食品添加剂。2 .2.3食 疗 剂 当今肥胖已经成为一种非常严重的疾病 ,它可以引起许多影响健康的问题 ,比如说糖尿病 、高血压 、动脉硬化等。抑制肥胖产生的主要方法是通过低 脂 肪饮食来控 制 ;另 一种 可行方法是在饮食的同时摄入一种纯天然物质,这种物质可以有选择性地限制肠道对脂肪的吸收。众所周知 ,在肠道吸收脂肪 的过程中 ,胰脂肪酶起着很重要的作用,因此 ,若存在某种物质能抑制胰脂肪酶活性,就可以有效的控制小肠对油脂的吸收。2003年Kidor首次报道关于脂 肪酶抑制剂活性特征及 - P L 对饭后甘油三脂的抑制作用 ,指 出 -PL 能够作用于含有胆盐和 磷 酸 胆碱 的乳剂并使其分解 ,从而抑制脂肪酶活性。这 些 结 果 表 明 ,-PL能 在 消化道中很好