酶的基本性质实验——底物专一性、激活剂和抑制剂、最适温度.ppt

实验六,酶的基本性质实验底物专一性、激活剂和抑制剂、最适温度,丁鸣,一、目的要求1.了解酶的专一性。2.掌握验证酶的专一性的基本原理及方法。3.学会排除干扰因素，设计酶学实验。二、基本原理酶是一种具有催化功能的蛋白质。酶蛋白结构决定了酶的功能酶的高效性，酶催化的反应（酶促反应）要比相应的没有催化剂的反应快1031017倍。酶催化作用的一个重要特点是具有高度的底物专一性，即一种酶只能对某一种底物或一类底物起催化作用，对其他底物无催化反应。根据各种酶对底物的选择程度不同，它们的专一性可以分为下列几种：,.酶的基本性质底物专一性,1.相对专一性一种酶能够催化一类具有相同化学键或基团的物质进行某种类型的反应。2.绝对专一性：有些酶对底物的要求非常严格只作用于一种底物，而不作用于任何其他物质。如脲酶只能催化尿素进行水解而生成二氧化碳和氨。如麦芽糖酶只作用于麦芽糖而不作用其它双糖，淀粉酶只作用于淀粉，而不作用于纤维素。3.立体异构专一性有些酶只有作用于底物的立体异构物中的一种，而对另一种则全无作用。如酵母中的糖酶类只作用于D-型糖而不能作用于L-型的糖。,本实验以唾液淀粉酶、蔗糖酶对淀粉、蔗糖水解反应的催化作用来观察酶的专一性。采用Benedict试剂检测反应产物。,Benedict试剂是碱性硫酸铜溶液，具有一定的氧化能力，能与还原性糖的半缩醛羟基发生氧化还原反应，生成砖红色氧化亚铜沉淀。Na2CO3+2H2O2NaOH+H2CO3CuSO4+2NaOHCu(OH)2+Na2SO4还原糖(CHOorC=O)+2Cu(OH)2Cu2O+2H2O+糖的氧化产物,（砖红色或黄色）,在分子结构上，淀粉几乎没有，而蔗糖全无半缩醛基，它们均无还原性，因此它们与Benedict试剂无呈色反应。淀粉被淀粉酶水解，产物为葡萄糖；蔗糖被蔗糖酶水解，其产物为果糖和葡萄糖，它们都为具有自由半缩醛羟基的还原糖，与Benedict试剂共热，即产生红棕色Cu2O沉淀。本实验以此颜色反应观察淀粉酶、蔗糖酶对淀粉和蔗糖的水解作用。,（醛基）,（酮基）,三、实验材料与试剂,1、实验材料蔗糖酶液(样品）;新鲜唾液（含唾液淀粉酶）；2、实验试剂蔗糖酶液蔗糖酶液(样品），使用浓度可参考“实验四蔗糖酶的酶活力测定”实验的情况来选择酶的稀释倍数（加蒸馏水稀释），备用；唾液淀粉酶液（学生自制）取0.5mL唾液至50ml量筒中，用蒸馏水（稀释）到50ml，用棉花过滤备用。唾液稀倍数因人而异，可稀释50400倍，甚至更高；5%蔗糖（A.R.）溶液；0.5%淀粉溶液（含0.3%NaCl）；Benedict试剂；,四、实验器材与仪器,1.漏斗，2.脱脂棉花；3.恒温水浴（37，100）；4.量筒；5.试管及试管架；6.烧杯；7.吸量管。,五、实验操作方法和步骤,检查试剂取3支试管，按下表操作：,注：检查目的：试剂是否有干扰因素存在。也可对蔗糖酶液、唾液淀粉酶液进行检查是否也有干扰因素存在，请自己设计。,1,2,3,检查试剂,试管编号：,淀粉酶的专一性取三支试管，按下表操作：,注：可增加一组唾液淀粉酶液经100加热3min处理后的样品对照组。,1,2,3,1,2,3,淀粉酶的专一性,试管编号：,注：可增加一组蔗糖酶液(样品）经100加热3min处理后的样品对照组。,蔗糖酶的专一性取三支试管，按下表操作：,1,2,3,1,2,3,蔗糖酶的专一性,试管编号：,六、结果分析讨论七、思考题1观察酶专一性实验为什么要设计这3组实验？每组各有何意义？蒸馏水有何用？2将酶液煮沸10min后，重做二、三的操作，观察有何结果？3在此实验中，为什么要用0.5%淀粉(0.3%NaCl)溶液？0.3%NaCl的作用是什么？八、注意事项1.试管要干净，所有试剂加量准确，加好试剂后要摇匀。2.使用试剂时不要人为造成试剂间的互相污染；试剂用好瓶盖要立即盖好，防止试剂间的互相污染。以免实验结果的错误。,.影响酶活性的因素激活剂和抑制剂,一、实验目的和要求1.了解激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响。2.学习检定激活剂和抑制剂影响酶促反应速度的原理和方法。二、实验基本原理在酶促反应过程中，酶的活性常受某些物质的影响，有些物质能使酶的活性增加，称为激活剂；某些物质它们并不引起酶蛋白变性，但能使酶分子上的某些必需基团（主要是指酶活性中心上的一些基团）发生变化，因而引起酶活力下降，甚至丧失，致使酶反应速度降低，称为酶的抑制剂。,酶的激活剂种类：1、一些简单的无机离子，如Mg2+、Cl-等；2、一些中等大小的有机分子，如抗坏血酸等也是激活剂，它们对某些含巯基的酶具有激活作用；3、有些酶的催化作用易受某些抑制剂的影响，因而能除去抑制剂的物质也可称为激活剂，如EDTA能除去重金属，因而能解除重金属对酶的抑制作用。4、具有蛋白质性质的大分子物质，这些激活剂是指可对某些无活性的酶原起作用的酶。酶的抑制剂有许多种：如重金属离子（Ag+、Hg2+、Pb2、Cu2等）、CO、氯化物、H2S、砷化物、氟化物、生物碱、有机磷农药等都是抑制剂。少量的激活剂或抑制剂就能影响酶的活性，而且常具有特异性。值得注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，各种激活剂对酶的作用是不同的。,本实验利用淀粉被水解的不同阶段产物与碘有不同颜色反应，定性观察唾液淀粉酶在酶促反应中激活或抑制现象。淀粉经酶促水解为葡萄糖的不同阶段的产物与碘作用的颜色反应如下：,淀粉紫色糊精红色糊精无色糊精麦芽糖葡萄糖I2显蓝色显紫色显红色不显色不显色不显色（碘色）（碘色）（碘色）,仍为多糖（无还原性）,（有还原性）,本实验中，Cl-为唾液淀粉酶的激活剂；Cu2+为唾液淀粉酶的抑制剂。,利用淀粉被水解的不同阶段产物与碘有不同的呈色反应，定性观察唾液淀粉酶在酶促反应中激活和抑制现象。,作用一定时间,水解产物+碘,淀粉+碘蓝色,淀粉+淀粉酶,水解的程度是通过水解混合物遇碘溶液所呈现的颜色之变化来判断的。,颜色变化,Cl-或Cu2+,三、实验材料与试剂,1、实验材料新鲜唾液2、实验试剂唾液淀粉酶（学生自制）取唾液1ml至50ml量筒中，用蒸馏水稀释至50ml，用棉花过滤备用。唾液稀释倍数因人而异，可稀释50400倍，甚至更高。0.1%淀粉溶液1.0%氯化钠溶液1.0%硫酸铜溶液1.0%硫酸钠溶液碘化钾-碘液,四、实验器材与仪器,1.试管及试管架2.量筒3.漏斗4.脱脂棉花5.点滴板6.吸量管7.恒温水浴（37）,五、实验操作方法和步骤,取试管4支，按下表操作：,注意：找出准确的保温时间，是本实验是实验能否成功的关键步骤之一，唾液淀粉酶液浓度可根据个人情况而定，通过37水浴溶保温计时，反应时间最好在815min以内，只有确定准确的保温时间才能进行实验。加入酶液后，务必充分摇匀，保证酶与全部淀粉液接触的反应才能得到理想的颜色梯度变化结果。碘化钾碘液不要过早地加到点滴板上，以免碘液挥发，影响显色效果。,1,2,3,4,1,2,3,4,六、结果分析讨论七、思考题1.激活剂可分哪几类？本实验中NaCl、硫酸铜是属于哪种类型？2.本实验中，1，2，3，4管各有何用意？为什么要设计第3管和第4管？3.抑制剂与变性剂有何不同？试举例说明。八、注意事项1.试管要干净，所有试剂加量准确，加好试剂后要摇匀。2.使用试剂时不要人为造成试剂间的互相污染，以免实验结果的错误。3.试剂用好瓶盖要立即盖好，防止试剂间的互相污染。4.两种淀粉不要弄错。5.激活剂抑制剂实验中，注意运用点滴板（显色板）来控制保温时间；如1，2，3，4管颜色反应无明显差别，可能是唾流淀粉酶活力太高或太低，若酶活性太高可将酶稀释后重做；若酶活性太低，可延长保温时间或增加酶的浓度。,.影响酶活性的因素温度，最适温度测定,一、实验目的和要求1.了解温度对酶活力的影响；2.学习测定最适温度的原理和方法；二、实验基本原理酶的催化反应受温度影响很大，每一种酶所催化的反应，在一定条件下，仅在某一温度范围内表现出最大的活力，即反应速度最大时的温度，这个温度称为该酶促反应的最适温度，高于或低于最适温度时，反应速度逐渐下降。因此，酶促反应与温度的关系，用酶活力对温度作图，通常具有钟罩形曲线特征。温度与酶活力的关系测定是选择一定的条件，把底物浓度、酶浓度、反应时间、pH等固定在最适状态下，然后在一系列不同温度条件下，进行反应初速度测定，以酶反应初速度对温度作图，可以得一个钟罩形的曲线，即为温度酶活性曲线，在某温度有一酶活力最大值，这个温度即为最适温度。,实验利用唾液淀粉酶为试验对象，在065之间选择不同的温度，进行酶活力测定。根据淀粉被唾液淀粉酶水解的程度的不同，遇碘呈现颜色的变化来判断酶活力的大小及最适温度。实验采用蔗糖酶为试验对象，在室温至75之间选择不同温度进行酶活力测定。蔗糖酶的活力常以其反应产物还原糖（葡萄糖）的生成量来表示。测定还原糖的方法很多，本实验选择3,5二硝基水扬酸法测定还原糖量。在碱性条件下，3,5二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原成红色氨基化合物，并在一定浓度范围内，还原糖的量与反应溶液所呈棕红色物质颜色的深浅程度成正比。因此，可以用分光光度法测定酶促反应后生成的还原糖量，从而测定蔗糖水解的速度和酶活力。,三、实验材料与试剂1、实验材料蔗糖酶液(样品），使用浓度可参考“实验四蔗糖酶的酶活力测定”实验的情况来选择酶的稀释倍数（加蒸馏水稀释），备用；新鲜唾液。2、实验试剂0.2mol/L醋酸缓冲液（pH4.6）5%蔗糖（A.R.）溶液（W/V）3,5二硝基水扬酸（简称DNS）试剂0.5%淀粉溶液（含0.3%NaCl）IK-I2溶液四、实验器材与仪器1.试管及试管架，2恒温水浴(37、50、65、75、100），3吸量管,4滴管,5点滴板，6分光光度计，7制冰机。,五、实验操作方法和步骤一、温度对唾液淀粉酶活力的影响1观察温度对酶活动的影响：取5支试管，按表4-1操作。2、绘制温度-酶活力曲线图，以反应温度为横坐标，反应液颜色的深浅程度（代表酶活力的大小）为纵坐标。绘制温度酶活力曲线（钟罩形），确定唾液淀粉酶的最适温度。,表4-1,注意：找出准确的保温时间，是本实验是实验能否成功的关键步骤之一，唾液淀粉酶液浓度可根据个人情况而定，通过37水浴溶保温计时，反应时间最好在815min以内，只有确定准确的保温时间才能进行实验。（2）加入酶液后，务必充分摇匀，保证酶与全部淀粉液接触的反应才能得到理想的颜色梯度变化结果。（3）碘化钾碘液不要过早地加到点滴板上，以免碘液挥发，影响显色效果。各管保温时间要相同。,二、温度对蔗糖酶活力的影响1、蔗糖酶最适温度的测定取试管7支进行编号，0号管为空白对照，以蒸馏水代替酶液，17号顺序为测定管，向各管加入0.2mol/L醋酸缓冲液（pH4.6）1ml，5%蔗糖溶液0.5ml，然后将各编号管依次放入相应温度（见表42）的恒温水浴或恒温箱中，预热3min，再逐管准确计时加入0.5ml经适当稀释的(已作相应的预温）蔗糖酶溶液(样品），迅速混匀；精确反应10min后，加入1ml3,5二硝基水杨酸（DNS）试剂，立即混匀，放入100水浴中加热5min。取出用流水冷却至室温后，向各管加入5ml蒸馏水，充分混匀。以0号管作空白对照A520值为零，在分光光度计上于520nm波长处测定各管的A520值，并作好记录。2、绘制温度酶的活力曲线图以反应温度为横坐标，相应的A520（表示反应初速度）为纵坐标，绘制出温度酶活力（A520值）曲线图，从而可以测出蔗糖酶在本实验条件下的最适温度。,表42,0,1,2,3,4,5,0,1,2,3,4,5,表42结果,六、结果分析讨论七、思