组织学基本技术ppt课件

组织学基本技术，1，内容概述，组织概念和研究内容组织学技术介绍组织标本的制备组织化学和免疫组织化学术组织学学习方法，2，1。组织学概念研究身体的微观结构和相关功能科学。2.研究内容是在细胞水平、细胞水平、分子水平研究身体。第一，组织学概念和研究内容，第3，2，组织学技术简介，显微技术组织学术图像分析技术细胞培养技术和组织工程，第4，显微镜技术，16世纪末荷兰眼镜商詹森和他的儿子将多个镜头放进一个圆筒中的结果，通过圆柱体詹森制造的第一台复合显微镜。基本原理是使用两个凸透镜，一个凸透镜，进一步放大其他凸透镜的形状。5，显微镜的历史，世界上第一台显微镜是荷兰眼睛匠詹森父子在1590年前后制作的，效果不理想。伽利略和钩子前后改良，效果更好。1878年用现代光学显微镜制作的。20世纪30年代制作了第一台电子显微镜。1981年出现了扫描隧道显微镜。6.显微镜根据光源分为光显微镜和电子显微镜两类。前者使用可见光作为光源，后者使用电子束作为光源。-，光学显微镜(a)普通光学显微镜(b)荧光显微镜(3)激光共焦扫描显微镜(4)暗视场显微镜(5)相位差显微镜(7)差分干涉差显微镜(8)反转显微镜、显微镜技术，7，尼机械部分：包括镜臂、载体台等。尼康E-600光学显微镜，8，尼康E800荧光显微镜，荧光显微镜由光源、过滤系统和显微镜三部分组成。光源是高压汞灯，产生波长和能量高的紫外线。原则：紫外线刺激标本的荧光物质，产生各种不同颜色的荧光，观察荧光的分布和强弱，测定被检查的物质。研究内容：观察组织或细胞内是否有天然荧光或荧光染料染色或标记的结构。9，莱卡倒置显微镜，倒置显微镜：构成与普通显微镜相同，不同的地方物镜和照明系统反转，前者在载波上，后者在载波下。研究内容：观察细胞培养中活细胞的形态结构和生长变化。倒置相位差显微镜：有相位差物镜，对活细胞的其他结构给予相当大的明暗对比和立体感。10，2，电子显微镜透射电镜扫描电镜，11，透射电镜，细胞内部结构观察，细胞表面三维结构观察，扫描电镜，12，透射电镜标本准备阶段，提取(约1mm3)，双固定(双醛固定液和锇四钬) 电子显微镜检查观察、14、精细组织标本制作有很多方法，包括切片法(石蜡切片和冷冻切片)、涂层法、漏斗法、粉碎法等。 组织学中最常用的方法是石蜡切片法。第三，组织标本的制备，第15，3，组织标本的制备，组织制作的重要性和目的组织标本制作方法组织切片标本制作的基本程序水木红染色程序，第16，组织制作的意义和目的组织制作技术随着生命科学的发展而不断发展。使用Staining(组织切片染色)方法制作的标本显示了各种组织细胞的不同结构和形态、相互连接以及其中特定化学成分的种类和内容的变化，为细胞分子学的研究提供了最直观的基础。因此，组织制作是研究医学和生物学的最基本、最重要的手段之一。17、组织标本制作方法、组织切片方法非组织切片方法、18、组织切片方法：利用化学试剂对组织进行一系列固定、脱水、透明后，利用石蜡、蜂棉凝胶、明胶等支撑物渗透组织内部，使组织保持一定的硬度，卡在块内，然后切片机(MMS)石蜡切片，蜂棉胶切片，明胶切片，冷冻切片等。19、组织不经组织切片程序制作的观察标本的组织方法是非组织切片方法。涂层、压花、薄膜、研磨、消化分离、活标本、完整标本、血管注射标本等。涂片：将采集的血液或骨髓样本染色给rehmann或jimma的标本。图钉：先将组织处理成小物质，然后用化学药品软化和染色，再用封面幻灯片密封在幻灯片上的标本。比如体育终板等。非组织切片方法，20，铺垫：通过手直接将需要观察的薄片组织铺在幻灯片上固定和染色等程序制作的标本。青蛙的肠系膜地毯，老鼠的皮下组织地毯等。研磨：不需要骨头、牙齿等组织、脱灰和切片，直接用手在磨上磨出约50微米左右的标本，装入彩色玻璃。消化分离：将组织分离成小块后，使用相应的化学药品水溶液溶于细胞间质消化，然后利用水的冲击冲击等将小组织分离成一个完整的细胞，染色后涂在封舰碎片上的标本上。平滑肌分离标本，脊髓运动神经细胞等。21，活体标本：将采集的观察标本添加到生理盐水中，然后直接用显微镜下滴入玻璃片进行观察。完整标本：先固定胚胎或小动物，然后在装满固定剂的透明容器中整体密封。另一种方法是将胚胎发育到特定阶段，然后固定、染色、脱水、透明地封在载体上的标本。血管注射标本：通过将有色物质注入血管，用酸或碱腐蚀血管周围组织而制成的整体密封的血管标本。在血管中注入有色物质后，用一系列制作技术处理后，为了显微镜观察，固定在玻璃片上的标本。22，切片：用于肝、肾等具有一定硬度的组织，23，涂末：用于血液、精液、唾液等液体组织。24，用于肠系膜等非常薄的组织的商店：25，磨削：用于骨头和牙齿等非常坚硬的组织。26，石蜡切片制造阶段，固定包埋切片染色密封，27，石蜡切片制造，(a)提取，注意：材料越新鲜，动作越快，准确，必须防止组织变形，自我溶解；使用的刀和剪刀必须锋利，以免损坏组织。采访部位适当、准确、容易说明问题。组织块应适当，便于固定液的渗透。组织大小适当，厚度一般不超过0.5厘米。28，(2)固定，目的：迅速凝固或沉淀组织内的蛋白质，防止细胞自行溶解或组织腐败，努力保持组织的原始结构和化学成分。29，简单固定液4%中性甲醛：用PH7.2-7.4的PBS制造，准备后密封，4 保管，保存一个月以下。染色和免疫组织化学。4%聚甲醛：PH7.2-7.4的PBS制备。乙醇混合固定液复合固定液AF(乙醇-甲醛)固定液Bouin固定液Carnoy固定液Zenker固定液，固定液种类，30，固定方法，浸渍固定：将组织切成小块，直接投入固定液中固定。灌注固定：通常是心脏灌注固定。固定更快，更均匀。特别适用于神经组织。31，固定主义，及时固定：最好在动物死后30分钟内固定，一般不超过2小时。固定液选择：根据组织的特性、染色法选择合适的固定液。固定数额：通常是组织体积的6-10倍。固定时间：保持组织形态结构，尽可能好地保存组织细胞抗原。固定温度：低温能保持良好的结构。32，高效、方便、快速的全自动形态检测平台！33，(3)染色，HE染色：组织学中最常用的染色方法。特殊染色：硝酸银染色、醛复合红染色、甲苯蓝染色等。34，镀银染色，神经元，H.E染色，35，小无情，碱性染料，碱性物质用蓝色，酸性染料，嗜酸性物质用红色染色，细胞核的染色质细胞质的核糖体，大部分细胞的细胞质(线粒体，溶酶体)当细胞增长超过60%时，取出幻灯片。用4%聚甲醛固定2小时以上。甘油的保管可以存放在零下20 。37，用细胞涂层制作，用离心法收集细胞，用预冷的PBS冲洗2-3次，然后用PBS重新挂起来。取30-50ul(可根据细胞量调节)，掉在加工好的幻灯片上，均匀地涂开。稍微干燥后，复盖4%以上的聚甲醛溶液，并固定2-4小时。在细胞上放一层甘油，保存到-20 。38，组织化学技术概念：应用化学反应或免疫反应等原理检测组织和细胞的化学成分，定位，量化技术。包括一般组织化学、免疫组织化学、原位杂交组织化学等。第四，组织化学和免疫组织学术，第39，原则：组织细胞中的物质(核酸、碳水化合物、脂质、蛋白质等)对该试剂做出反应，最终形成有色最终产物，通过有色最终产物在细胞内的位置和颜色的深度确定特定物质的分布和含量。特征：组织学标本中可以定位、定性和定量显示分布在组织或细胞内的特定物质。40，糖和碘酸-Schiff反应(PAS反应)DNA聚根反应(Feulgenreaction)DNA和RNA甲基绿-巴佐宁反应脂质脂溶性染料(反应产物呈紫红色。42，Feulgen反应：显示DNA。甲基绿-巴佐宁的反应：DNA核RNA呈蓝绿色，RNA呈红色。洋葱鳞茎表皮细胞，43，苏丹红染色：脂质为红色。冰冻切片在地质上保持得更好。44，酶：酶在适当的温度和PH条件下催化某些基质，形成初级反应产物，然后用捕获剂捕获其产物，形成镜中可见的着色沉淀物。该技术被用于检测酶活性，而不是酶本身。45，(b)免疫组织学术，1 .概念和原理：根据抗原和抗体特异性结合原理检测组织、细胞内多肽和蛋白质等大分子物质的技术。将显示的抗体与组织的抗原结合，然后通过化学反应显示抗原抗体结合部位，通过显微镜观察，确定检测物质的分布、含量。46，2。标记类型荧光染料：如异硫氰酸盐氟(FITC)、四甲基异硫氰酸盐罗丹明(TMRITC)、荧光显微镜下的酶观察：如辣根过氧化物酶、光学显微镜或电子显微镜观察。胶体金：主要用于电镜观察。47，免疫组织化学原理模式，抗原抗体复合物，路西法，辣根过氧化物酶，胶体金，48，3。免疫组织化学技术的种类，根据染色阶段：直接方法：直接标记第一抗体。该方法简单，特异性强，但灵敏度低。间接方法：不显示第一抗体，显示第二抗体。这个方法灵敏度高。特殊的间接方法：第一抗体和第二抗体都没有标记，用酶标记与第二抗体结合的物质。这个方法灵敏度高。包括PAP方法、ABC方法、SABC方法等。，49，取决于标记：免疫荧光技术：免疫胶体金技术：免疫酶标准技术：目前最常用的方法。包括PAP方法、ABC方法、SABC方法等。与免疫荧光技术相比，具有位置准确、对比度好、染色标本长期保存，适合光镜、电子显微镜研究的优点。50，荧光标记免疫组织化学，直接法间接法，51，免疫组织化学免疫组织化学技术注意事项：组织固定越新鲜越好。固定液使用多4%的聚甲醛，固定时间不能太长。组织脱水要彻底。切片必须完整平整，没有气泡，没有褶皱。切片附着必须牢固。幻灯片需要特殊处理。切成薄片，完全脱下蜡。56，4。免疫组织化学技术注意事项：常用抑制剂为3%过氧化氢，可完全抑制内源性过氧化物酶活性，减少背景染色。合理使用封闭剂可以减少非特异性染色。肺血清一般是与二项式相同的来源，可以使用绵羊血清、小牛血清等，但不能与一项一致。抗原修复：57，4。免疫组织化学技术注意事项：选择适当的抗体。抗体使用注意事项。PBS清洗：PBS要求：ph 7.2-7.6；浓度：0.02米。单独冲洗柔软冲洗彻底清洗，58，4。免疫组织化学技术注意事项：DAB颜色注意事项：DAB是致癌物质，不要倒进游泳池，注意自我保护。新鲜准备：发色前10-15分钟准备。室温比色，在镜下需要调整比色时间，通常需要5-30分钟左右。59，洗涤剂清洗，泡沫酸，临时防脱处理(明胶，聚赖氨酸，APES)，流动水清洗，在烤箱中燃烧，流动水清洗，蒸馏水清洗，烤箱燃烧干燥，常用的抗原修复法是微波修复法、高压加热法、煮加热法、酶消化法等PH6.0的柠檬水缓冲液。抗原修复，61，一元选择：选择单克隆抗体或多克隆抗体。单克隆抗体特异性强，灵敏度低。多克隆抗体特异性略弱，敏感性高，容易产生非特异性染色。通过实验动物选择物种来源。免疫组织能否化学。检验标本类型：石蜡切片，冷冻切片制造商：国内、国外。选择两种阻力：根据一种阻力种类选择两种阻力源。选择抗体，62，抗体保存：浓缩液在-80 保存约3年。购买后抗体应在灭菌状态下分成小包装，用蜡膜密封。重复的冻融。选择最佳抗体稀释度：抗体稀释剂用氯血清，BSA或脱脂奶粉等。添加抗体：切片湿润，抗体量下降，最好是一滴50ul。选择合适的孵化时间：4