酶活性测定方法

体系一酶和蛋白质提取消过毒的打孔器进行伤口处理后，在每个伤口处添加50mL以下处理：（1）无菌水，对照；（2）浓度为1000mg/mlGA3；（3）浓度为1 104 spores/mlP. expansum孢子悬浮液；（4）浓度为1000mg/mlGA3+浓度为1 104 spores/mlP. expansum孢子悬浮液。处理后湿纱布覆盖并用PE塑料膜密封作保湿处理。贮藏于常温（20-25）下。分别在0、12、24、36和48小时取样进行测定酶活性。取样时沿伤口用刀小心切下1g果实组织，加入10 mL冷(4)的50 mmol/L磷酸缓冲液（PBS）内含1.33 mmol/L EDTA和1% PVPP缓冲液(pH 7.8)。研钵加入少量液氮预冷后，在冰浴中碾磨，破碎组织，然后在冷冻离心机12000rpm离心15分钟。取上清液供酶活性和蛋白质含量用。蛋白质含量测定试验材料和试剂：牛血清白蛋白标准溶液：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000gmL的原液。8.1.2 蛋白试剂考马斯亮蓝G-250：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90乙醇中，加入85（WV）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。8.1.3 乙醇；磷酸（85）。试验方法：分别取牛血清白蛋白标准溶液（1000gmL）0,、10L、20L、40L、60L、80L、100L，无菌水补至100L，加入考马斯亮蓝G-250试剂5mL，作为标准溶液；分别取标准溶液和上清液（试验7中得到）400L加到酶标板，以无菌水置零，测定OD595；酶活的测定9.1 试验材料和试剂9.1.1 氮蓝四唑；甲硫氨酸；核黄素；过氧化氢；愈创木酚；邻苯二酚。9.1.2 Na2HPO4-12H2O；NaH2PO4-2H2O。9.1.3 磷酸缓冲液PBS配制母液：0.2M Na2HPO4：称取71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于1000ml 水；0.2M NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 水。按表2配制0.2M的PB（mL），最后稀释至所要的浓度表1 不同pH值PBS的配制pH0.2M Na2HPO4（mL）0.2M NaH2PO4（mL）6.426.573.57.062387.891.58.59.2 试验仪器9.3.1 200L、1000L移液枪，eppendorf；9.2.2 酶标仪，；9.2.3 酶标板，JET BIOFIL9.3 试验方法 9.3.1 超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性的测定SOD采用氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）法（Beauchamp和Fridovich，1971）6。反应步骤为：取200l粗提液，加入3.7 ml NBT反应液50mmol/LpH7.8的磷酸缓冲液（PBS）配制的含77.12mol/L氮蓝四唑, 100mol/LEDTANa2和13.37mmol/L甲硫氨酸溶液，在30下保温2分钟后加入100l核黄素溶液（pH7.8的50mmol/L磷酸缓冲液中含80.2mol/L 核黄素和100mol/LEDTANa2），在4000Lx日光下反应20min。然后迅速测定A560。以不照光的管做空白。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400L。酶活性按以下公式计算：以抑制NBT光化还原的50为一个SOD活性单位，结果以U/mg蛋白表示。以加缓冲液代替酶液的作为对照。SOD总活性(AckAE)V/(Ack0.5WVt)式中， Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时样品用量（ml）；W为样品鲜重（g）或蛋白质含量（mg）。9.3.2 过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性测定CAT 活性参照Aebi (1984)7的方法进行测定。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400L 。400 L反应液含50 mmol/L的PBS (pH 7.0)，30 mmol/L的H2O2和50 L粗酶液。反应从加入过氧化氢开始计时，连续测定在240 nm吸光度的降低值。酶活性定义为：一个过氧化氢酶单位相当于在规定条件下于温度25，pH7.0条件下1分钟分解1mol过氧化氢所需酶量，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。9.3.4多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定PPO活性测定采用邻苯二酚法（Aquino-Bolaos和Mercado-Silva，2004）8。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400L。350L反应液（用50mmol/L，pH6.4的PBS配制，内含100mol/L邻苯二酚）中加入50 L的粗酶液，平衡1分钟后连续测定398nm吸光度的变化。以1分钟内398nm吸光度上升0.01为一个酶活性单位，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。9.3.5 过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性测定POD活性测定采用愈创木酚法（Lurie等，1997)9。用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400L。反应体系为30L粗酶液，290 L 0.3%愈创木酚（用50 mmol/L的PBS配制，pH 6.4）和 80L0.3%H2O2（用50 mmol/L的PBS配制，pH 6.4）。反应在加入H2O2 后开始准确记时。连续吸光度在470 nm的上升值。酶活性以每分钟上升0.01为一个单位，结果以U/mg蛋白或U/g鲜重表示。体系二SA对苹果果实抗性相关酶活性的影响用消过毒的打孔器在每个果实表面形成统一大小和深度的伤口。每个伤口处等量（30l）加入（1）SA溶液（10g/ml）；（2）酵母悬浮液（108 cells/ml）；（3）用SA溶液（10g/ml）配制的酵母悬浮液（108 cells/ml）；（4）无菌水（作为对照）。处理后贮藏于常温（20 C），并用PE塑料膜密封作保湿处理。定期取样对组织酶活性和蛋白质含量进行测定。取样时先用无菌刀片表皮组织，然后用打孔器分别在伤口处和离开伤口组织5mm位点取样。每个处理重复3次，每个重复6个果实。整个实验重复2次。2.7.3 SA对梨果实POD活性影响完好的果实在SA（100 g/ml）溶液中浸泡10分钟后贮藏于常温（20 C），然后定期取样对组织POD活性进行测定。以无菌水处理的为对照。提取时先用刀片削去表皮组织。每个处理重复3次，每个重复6个果实。整个实验重复2次。2.7.4 酶提取和测定的程序1克果实组织加入10 ml冷(4)的50 mmol l-1磷酸缓冲液（PBS）内含1.33 mmol l-1 EDTA和1% PVPP缓冲液(pH 7.8)。加入少量石英砂在冰浴中碾磨，破碎组织，然后在冷冻离心机12000rpm离心15分钟。取上清液供酶活性和蛋白质含量用。蛋白质含量按Bradford（1976）的方法进行。2.7.5 超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性的测定SOD采用氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）法（Beauchamp和Fridovich，1971）。反应步骤为：取200l粗提液，加入3.7 ml NBT反应液50mmol/l pH7.8的磷酸缓冲液（PBS）配制的含77.12mol/l氮蓝四唑, 100mol/l EDTANa2和13.37mmol/l甲硫氨酸溶液，在30下保温2分钟后加入100l核黄素溶液（pH7.8的50mmol/l磷酸缓冲液中含80.2mol/L 核黄素和100mol/lEDTANa2），在4000Lx日光下反应20min。然后迅速测定A560。以不照光的管做空白。（用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400l，下同）。酶活性按以下公式计算：以抑制NBT光化还原的50为一个SOD活性单位，结果以U/mg蛋白表示。以加缓冲液代替酶液的作为对照。SOD总活性(AckAE)V/(Ack0.5WVt) 式中， Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时样品用量（ml）；W为样品鲜重（g）或蛋白质含量（mg）。2.7.6 过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性测定CAT 活性参照Aebi (1984)的方法进行测定。3ml反应液含50 mmol/l的PBS (pH 7.0)，30 mmol/l的H2O2和50 l粗酶液。反应从加入过氧化氢开始计时，连续测定在240 nm吸光度的降低值。酶活性定义为：一个过氧化氢酶单位相当于在规定条件下于温度25，pH7.0条件下1分钟分解1mol过氧化氢所需酶量，结果以U/mg蛋白表示。2.7.7 过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性测定POD活性测定采用愈创木酚法（Lurie等，1997)。反应体系为200l粗酶液，2.2 ml 0.3%愈创木酚（用50 mmol/l的PBS配制，pH 6.4）和 0.6 ml 0.3%H2O2（用50 mmol/l的PBS配制，pH 6.4）。反应在加入H2O2 后开始准确记时。连续吸光度在470 nm的上升值。酶活性以每分钟上升0.01为一个单位，结果以U/mg蛋白表示。2.7.8 多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定PPO活性测定采用邻苯二酚法（Aquino-Bolaos和Mercado-Silva，2004）。2.9ml反应液（用50mmol/l，pH6.4的PBS配制，内含100mol/l邻苯二酚）中加入100 l的粗酶液，平衡1分钟后连续测定398nm吸光度的变化。以1分钟内398nm吸光度上升0.01为一个酶活性单位，结果以U/mg蛋白表示。2.7.9 苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）活性的测定PAL活性测定参照Camm和Towers（1973）的方法进行测定。1ml粗酶液中加4ml硼酸盐缓冲液 (pH 8.8)含10mmol/L 苯丙氨酸；对照不加粗酶液，另加1ml蒸馏水。反应液在恒温水浴30中保温0.5h后，测定290nm处吸光度。以每小时在290nm处吸光度变化0.01所为一单位，结果以U/mg蛋白表示。2.7.10 脂氧合酶(linoleate:oxygen oxidoreductase，LOX)活性的测定LOX活性参照Todd等 (1990)的方法进行测定。反应体系为2.8ml反应液（用40 ml浓度为 0.1mol/l PBS内含200 ml的 Tween 20和40 ml的亚油酸，pH 7.0）中加入200ml的粗酶液。平衡1分钟后连续测定234nm吸光度的变化。以1分钟内234nm吸光度上升0.01为一个酶活性单位，结果以U/mg蛋白表示。体系三（柑橘）1 酶提取和测定的程序（SOD、POD、PPO、LOX）0.300 g 果实组织加入4.5 ml冷(4)的50 mmol l-1含1.33 mmol l-1 EDTA和1% PVPP PBS缓冲液(PH 7.8)。加入少量石英砂在冰浴中碾磨，破碎组织，然后在冷冻离心机12000rpm离心10分钟。取上清夜作为酶活性等指标样品。蛋白质含量按Bradford（1976）的方法进行。1.1 超氧物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性的测定SOD采用氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）法（Beauchamp和Fridovich，1971）。反应步骤为：取200l粗提液，加入3.7 ml NBT反应液（50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）配制的含77.12mol/L 氮蓝四唑, 100mol/L EDTANa2和13.37mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液）后在30下保温2分钟后加入100l核黄素溶液（pH7.8的0.05mol/L 磷酸缓冲液中含80.2mol/L 核黄素和100mol/L EDTANa2），在4000Lx日光下反应20min。以加缓冲液代替酶液蒸馏水的作为对照。然后迅速测定A560。以不照光的管做空白。（用酶标仪进行测定时按比例调整为总反应体积为400l，下同）。酶活性按以下公式计算：以抑制NBT光化还原的50为一个SOD活性单位，结果以U/mg蛋白表示。SOD总活性(AckAE)V/(Ack0.5WVt) 式中， Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）W样鲜重（g）/蛋白质含量单位为：mg蛋白g鲜重。1.2过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性测定POD 活性测定采用愈创木酚法（Lurie等，1997）。反应液为20 l 离心后粗酶液，220 l of 0.3% 愈创木酚（用50 mM PBS配制, pH 6.0）, 60 l of 0.3%H2O2（用50 mM PBS配制, pH 6.0），反应在加入H2O2 后开始准确记时，连续吸光度在470 nm的上升值。酶活性以每分钟上升0.01为一个单位，结果以U/mg蛋白表示。1.3 多酚氧化酶（Polyphenoloxidase，PPO）活性的测定PPO活性测定采用邻苯二酚法（Aquino-Bolaos和Mercado-Silva，2004）。用50mmol/l pH 6.4的PBS配制的10 mmol/l邻苯二酚反应液（290l）再加入10 l 酶粗提液，平衡1分钟后连续测定398nm吸光度的变化。以1分钟内398nm吸光度上升0.01 为一个酶活性单位，结果以U mg -1 protein表示。1.4 脂氧合酶(linoleate:oxygen oxidoreductase，LOX)活性的测定LOX活性参照Todd等 (1990)的方法进行测定。反应体系为280ul反应液(40 ml 0.1MPBS, pH 7.0内含200 ml Tween20和40 ml 亚油酸)加入20 ml 酶提取液。在加入酶提取液、并平衡1分钟后连续测定234nm吸光度的变化。以1分钟内234nm吸光度上升0.01为一个酶活性单位，结果以U mg -1 protein表示。(可以尝试7.0EDTA+PVP的提取液)2 酶提取和测定的程序（CAT）0.300 g 果实组织加入3 ml冷(4)的 50mmol l-1含5 m mol l-1 DTT PBS缓冲液(PH 7.0)。加入少量石英砂在冰浴中碾磨，破碎组织，然后在冷冻离心机12000rpm离心10分钟。取上清夜作为酶活性等指标样品。蛋白质含量按Bradford（1976）的方法进行。2.1 过氧化氢酶（Catalase，CAT）活性测定CAT 活性参照Aebi (1984)的方法进行测定。290l反应液含50 m mol l-1 PBS (pH 7.0)，20 mM H2O2，酶粗提液加入量为20 l。反应从加入过氧化氢开始计时，连续测定在240 nm吸光度的降低值。酶活性定义为:一个过氧化氢酶单位相当于在规定条件下于温度25, pH 7.5条件下1分钟分解1mol过氧化氢所需酶量，结果以U/mg蛋白表示。3 酶提取和测定的程序（MDA）0.300g果实组织加入10%三氯乙酸（TCA）4.5 ml 和少量石英砂，研磨；然后匀浆液在冷冻离心机4 000rpm离心10分钟。取上清夜作为酶活性等指标样品。蛋白质含量按Bradford（1976）的方法进行。3.1 过氧化作用的测定以丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量表示过氧化作用。测定方法参照Du和Bramlage（1992）。吸取等体积的离心上清液和 0.6 % TBA硫代巴比妥酸（溶于10 % TCA）溶液2 ml（对照不加上清液而加入等体积蒸馏水）摇匀后将试管放入沸水浴中煮沸 10 min （自试管内溶液中出现小气泡开始计时） ，取出试管并迅速在冰浴中冷却， 4000 r/min 离心 15 min ，取上清液并量其体积。以 0.6% TBA 溶液为空白。测定 532 nm、600 nm和450 nm 处的吸光度值。按以下公式计算MDA 含量：MDA 含量 ( mol/g或mg protein)=6.45（A532-A600）0.56A450提取液体积（ml）样品重量(g)或蛋白质毫克数1000TBA先溶于5%-10% NaOH，后加TCA至 0.6%。TBA溶于碱，不易溶于酸4 酶提取和测定的程序（PAL）0.300g 果实组织加入 pH 8.8 的5mmol l-1巯基乙醇硼酸缓冲液（含0.1g/L PVP）4.5 ml。加入少量石英砂在冰浴中碾磨，4，然后在冷冻离心机11 000rpm离心20分钟。取上清夜作为酶活性等指标样品。蛋白质含量按Bradford（1976）的方法进行。4.1苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）活性的测定PAL活性测定参照Engelsma G（1974）的方法进行测定。1 ml 粗酶液加2 ml 0.1mol/L硼酸缓冲液（pH 8.8）和1 ml 0.02mol/L L-苯丙氨酸，总体积为4ml。空白不加酶液，反应液置恒温水浴37中保温0.5h后用测定在290nm处测定吸光度。以每小时在290nm处吸光度变化0.01所为一单位（相当每毫升反应混合物形成1g肉桂酸），活性以U/mg蛋白表示。5酶提取和测定的程序（GR）0.300g 果实组织加入 50g/L的三氯乙酸（TCA）溶液（含5mmol/L Na2-EDTA）4.5 ml。加入少量石英砂在冰浴中碾磨，4，然后在冷冻离心机12 000g离心20分钟。取上清夜作为酶活性等指标样品。蛋白质含量按Bradford（1976）的方法进行。5.1还原型谷胱甘肽（GR）含量的测定标准曲线的制作项目试管号012345100umol/L还原型谷胱甘肽标准液/ml00.20.40.60.81.0蒸馏水/ml1.00.80.60.40.200.1mol/L pH7.7磷酸缓冲液/ml1.01.01.01.01.01.04mmol/L DTNB试剂/ml0.50.50.50.50.50.5相当于还原型谷胱甘肽的量/umol020406080100按照列表加入各种试剂，混匀，25保温反应10min。以零号管为参比调零，测定显色液在412nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，还原型谷胱甘肽物质的量（umol）为横坐标，绘制标准曲线。5.2 GR含量测定分别向加入0.5 ml粗酶液及0.5 ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.7）的试管中加入0.25 ml 4mmol/L DTNB试剂或0.25 ml 磷酸缓冲液（pH 6.8）。以标准曲线的0号管液作为空白，反应液置恒温水浴25中保温10 min后，迅速测定显色液在412nm处吸光度，分别记作ODs和ODc，反应混合液中还原性谷胱甘肽反应吸光度为ODs-ODc。重复三次。结果以还原性谷胱甘肽含量（umol/g）表示：还原性谷胱甘肽含量（umol/g）=(n*V)/(Vs*m) 式中， n为由标准曲线查得的溶液中还原型谷胱甘肽物质的量（umol）V为样品提取液总体积（ml）Vs为吸取样品液体积（ml）M为样品质量（g） 6