激光扫描共聚焦显微镜技术PPT课件

.,1,激光扫描共焦显微镜技术LaserScanningConfocalMicroscopy,FruitFlyEmbryoNervousSystem,.,2,.,3,Medicago（苜蓿）crosssectionofastemshowinglignin（木质素）autofluorescenceinblueandchloroplastautofluorescenceinred.ThisimagewastakenwiththeLeicaAOBSconfocalmicroscope,.,5,主要内容,.,6,激光扫描共聚焦显微镜技术（LaserscanningConfocalMicroscopy，简称LSCM）是近代生物医学图象仪器的最重要发展之一，它是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图象处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、组织胚胎学、免疫学和神经生物学等领域，对生物样品进行定性、定量、定时和定位研究具有很大的优越性，为这些领域新一代强有力的研究工具。,.,7,有关共聚焦显微镜的某些技术原理，早在1957年就已提出，20年后由Brandengoff在高数值孔径透镜装置上改装成功具有高清晰度的共聚焦显微镜，1985年WijnaendtsVanResandt发表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生物学中应用的文章，到了1987年，才发展成现在通常意义上的第一代激光扫描共聚焦显微镜。,一、激光扫描共聚焦显微镜成像的基本原理,.,8,1水银弧光灯2中密度滤片3光镧4场镧5激发滤片6分光镜（BSP)7物镜8样品9,10发射滤片11目镜,Basicsofconventionalfluorescencemicroscope,.,9,FluorescentMicroscope,Objective,ArcLamp,EmissionFilter,ExcitationDiaphragm,Ocular,ExcitationFilter,.,10,ConfocalPrinciple,Objective,Laser,EmissionPinhole,ExcitationPinhole,PMT,EmissionFilter,ExcitationFilter,.,11,Differencesbetweenconventionalandconfocalmicroscope,1,1,2,2,观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构）。,.,12,共聚焦显微镜一次只有样品的小部分区域被照明，而普通荧光显微镜则有更宽的区域被照明。,.,13,共聚焦扫描显微镜的成像原理激光作为光源采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。扫描方式成像激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。光点共聚焦光源和探测器前方都各有一个针孔（照明针孔和探测针孔）。直径约100-200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终同时聚焦于照明针孔和探测针孔。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。,.,14,ConfocalPrinciple,照明针孔,探测针孔,二色镜或分光镜,激光光源,.,15,.,16,.,17,激光光源扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器）自动显微镜控制系统（数字信号处理器、计算机）图象输出设备（显示器、打印机、存储器）,二、激光扫描共聚焦显微镜的基本结构,.,18,.,19,1,2,3,4,5,5,4,.,20,1,2,3,4,5,3,4,.,21,.,22,共聚焦显微镜的主要优点,高分辨率：图像与对比度增强，使用短波长的紫外光，大大提高了分辩率。是普通荧光显微镜分辨率的1.4倍（0.51/0.37),普通荧光显微镜分辨率,共聚焦显微镜分辨率,.,23,.,24,.,25,共聚焦显微镜应用常见错误认识,在实际应用中尽管几乎所有标本都采用的是荧光标记，但决不能将LSCM认为就是一种“高质量图像的荧光显微镜”.共聚焦显微镜并不总是荧光检测的最好工具。共聚焦显微镜能同时或序贯检测多种荧光通道，但不能将共聚焦显微镜简单地作为一种共存研究的工具。,.,26,共聚焦显微镜真正的威力是依赖于其强烈抑制焦平面外荧光信号的能力，有很好的深度分辨能力或光学切片功能。基于该性质的应用包括:样品的显微断层扫描(microscopicCT)Z扫描切片的3-D重建厚样品的分辨率,.,27,多通道同时检测，可实时检测细胞的生理活动和形态变化:生理学研究：如细胞内各种离子浓度随时间的变化情况.活细胞多种标记物同时进行成像，动态观察不同形态学事件的发生。如分泌颗粒的分泌过程。,vestigialapterousCiD(cyanine5).,三、激光扫描共聚焦显微镜的应用,.,29,Notjustthestructureofasinglecell,therelationshipofadjacentcellsatdifferentplanecanalsobeviewedclearlylikebelow:,.,30,.,31,HertelL.A.,StrickerS.A.andLokerE.S.2000.CalciumdynamicsofhemocytesofthegastropodBiomphalariaglabrata:effectsofdigenetictrematodesandselectedbioactivecompounds.InvertebrateBiology,v.119(#1):27-37.,腹足纲一种淡水螺Biomphalariaglabrata血细胞的钙离子动态变化探针：CalciumGreenFuraRed,CalciumGreen,FuraRed,10s,肾上皮细胞有丝分裂共聚焦显微镜观察mCherryH2B_mEmEB3,骨肉瘤细胞内的内质网mEmerald_ER,负鼠肾上皮细胞内体EGFP_Endosomes,负鼠肾上皮细胞内溶酶体,HeLa细胞的过氧化物酶体,.,38,.,39,.,40,.,41,Afocusmotorcanmovethestageinpreciseincrementssothatmultipleimagesfromconsecutiveplanescanbeindividuallyscannedandsaved.,.,42,步进电机0.1m,.,43,Bycollectingaseriesofimagesofthespecimenatdifferentdistancesfromthelens(focalplanes)athrough-focusseriesor“Z-series”canbecreated.,.,44,Lodgepolepine(黑松),.,45,.,46,NatureCellBiology5,15(2003),Yellowandredfluorescencerepresentsacridineorange-stainedsecondarycellwallsandchloroplasticautofluorescence,respectively.The3Dimagewasreconstructedfromopticalsectionsobtainedonaconfocalmicroscope(FV500,Olympus).Scalebarrepresents20m.,.,49,motornerve-Cy2musclebagfiber-Cy3Nucleus-DAPI,.,50,细胞膜（AlexaFluor488）,AlexaFluor594标记的单壁碳纳米管,透射光通道,重叠图像,Hela细胞内化碳纳米管过程,12hat37C,Aconfocalopticalsectiondemonstratesthatduringtelophase,microtubules(red)formaphragmoplast(桶状纺缍体)arrayandperoxisomes(green)aggregateimmediatelyinsidethese.TheDNAinthenucleiisstainedblue.ImagefromCollingsetal.(2003).,PeroxisomesMicrotubulesDAPI,Peroxisomalaggregationinonionmaybeinvolvedinmembraneproductionand/ormetabolismduringcelldivision,.,53,Theroleofhyaluronaninrenalstonediseasehttp:/www.glycoforum.gr.jp/science/hyaluronan/HA29/HA29E.html,透明质酸,.,54,Hyaluronanisexpressedbyproliferatingrenaltubularcellsinsubconfluentcultures(2dayspost-seeding).Atcell-cellcontact(4dayspost-seeding)thisstainingstartstofadeawaytocompletelydisappearwhenthetightjunctionsareassembled(5-6dayspost-seeding).ThehyaluronanreceptorCD44isalsoexpressedattheluminalsurfaceinsubconfluentcultures(2dayspost-seeding),atcell-cellcontactCD44istargetedtolateralspaces,whereasatconfluence(6dayspost-seeding),CD44isexclusivelyexpressedatbasaldomainsoftheplasmamembrane.,.,55,Theabovetwoimagesaretakenfromthesamefieldoftheplantof60mthickbydifferentmeans.ThefirstoneistakenbyCCDcamerainthewildfieldmicroscopeconfiguration.thesecondoneistakenbyconfocalmicroscopywithpinholesizeatoneAiryunit.,.,56,共聚焦扫描显微镜在生命科学研究中的应用细胞结构、蛋白质（如受体、抗原、抗体、酶、细胞骨架蛋白等基因表达产物）、DNA、RNA等细胞膜流动性（荧光光漂白恢复技术）细胞内活性氧变化细胞内钙离子浓度变化膜电位,.,57,四、量子点在生物及医学分析中的应用,.,58,量子点(QuantumDots，QDs)（LuminescenceSemiconductornanocrystals发光半导体纳米晶体）由于量子点具有独特的光学特性,20世纪70年代，应用主要集中在电子与光学方面20世纪80年代，生物学家已经对量子点产生了浓厚的兴趣，但由于它的荧光量子产率低，工作集中在研究量子点的基本特性方面1997年以来，量子点制备技术的不断提高,量子点已越来越可能应用于生物学研究。量子点可作为生物探针是从1998年AlivisatosAP.ChanWC两个研究小组开始，此后量子点的功能进一步被发现、推广，使之成为生物学领域研究的热点。,.,59,量子点通常以CdSe为核、CdS或ZnS为壳的核-壳型纳米体，与传统的有机染料相比，它有其独特的性质：,.,60,量子点具有较大的斯托克位移和狭窄对称的荧光谱,Figs(A)Excitation(dashed)andfluorescence(solid)spectraoffluorescein(B)atypicalwater-solublenanocrystalsampleinPBS,.,61,单个波长可激发所有的量子点,而不同染料分子的荧光探针需多个激发波长应用范围广：可用于多领域和多仪器多种颜色：颜色取决于量子点的大小，在同一激发波长下，可发出多种激发光，达到同时检测多种指标的要求。抗光漂白性安全：细胞毒性低，可用于活细胞及体内研究荧光时间长：荧光时间较普通荧光分子长数千倍，便于长期跟踪和保存结果,长颈瓶中不同尺寸的硒化镉(CdSe)量子点在紫外线的照射下发出不同颜色的荧光,.,62,Quantumdotfluorescenceimageofmousekidneysection,.,63,QDfluorescenceimageofmousesmallintestine,.,64,QD可用于非同位素标记的生物分子的超灵敏检测，如在QD表面连接上巯基乙酸（HS-CH2COOH),从而使量子点既具有水溶性，还能与生物分子（如蛋白质、多肽、核酸等）结合，通过光致发光检测出QD，从而使生物分子识别一些特定的物质。,SchematicofaZnSCappedCdSeQDthatiscovalentlycoupledtoprotein,.,65,Quantumdotscatchcancerearly,QDsaredepictedasgoldspheresthatattractDNAstrandslinkedtocancerrisks.WhentheQDareexposedtocertaintypesoflight,theytransfertheenergytofluorescentmolecules,shownaspinkglobes,thatemitaglow.ThisenablesresearcherstodetectandcounttheDNAstrandslinkedtocancer.(Credit:YiZhang/JohnsHopkinsUniversity),/science-technology/quantum-dots-catch-cancer-early/,.,66,AQD-EGFbindsandactivatescellsexpressingaGFP-fusedEGFR.(a)RedQD-EGFandgreenGFP-EGFRcolocalizeonthecellmembranewithinminutesand(b)arerapidlyinternalizedtogetherintoendosomesinthecytoplasm.(c)IndividualreceptorsonlongsensoryfilamentscalledfilopodiacanbevisualizedbyQD-EGFbinding.Imagesaresingleconfocalsectionsthroughlivingcells.,.,67,SnapshotsintimeshowingretrogradetransportofQD-EGF-receptor-activatedcomplexesonafilopodium,cellsexpressingtheEGFR-EGFPfusionproteinafterashortincubationwithcomplexesofEGF-QDnanoparticles.(Creditforimageandlegend:MaxPlanckInstituteforBiophysicalChemistry).,.,69,内化过程动态显示,NatureBiotechnology22,198-203(2004),.,71,.,72,还可进行脉冲追踪实验(pulse-chaseexperiments),观察融合内体的寿命.Inpulse-chaseexperimentsusingtwodifferentcolorsofQD-EGF,bindingandendocytosisoforangeQD-EGFbyEGFRwasfollowed22minlaterbyblueQD-EGF.FewendosomescontainbothcolorsofQDs(purpledots)whenthepulsesareseparatedbymorethan15min,.,73,Bi