WB过程中常见问题及处理方法

WB过程中的常见问题和处理方法，对WB的介绍，WB是蛋白质印迹。它是分子生物学、生化和免疫遗传学中常用的一种实验方法。基本原理是通过特定抗体对凝胶电泳处理的细胞或生物组织样本进行着色，分析着色位置和着色深度，获得有关正在分析的细胞或组织中特定蛋白质表达的信息。应用程序1。目的分析蛋白质的表达特性2。目的蛋白质与其他蛋白质的相互作用3。目的蛋白质的组织定位4。目的蛋白质的表达分析，3，WB影响因素，步骤多的话，任何一个步骤都可能影响结果1，电泳分离蛋白的提取；蛋白质定量；样品制备变性；样品数；电泳(电压，电流大小，胶浓度，胶)，2，薄膜选择；刚确认；特殊处理.3，封闭液体选择；封闭条件优化；4，选择冲洗液的制备和选择冲洗时间和数量，5，选择抗体孵化抗体和稀释液；抗体稀释倍数优化；抗体培养时间；6，曝光时间控制，4，注意事项，1。蛋白质样品提取，尽可能避免新组织或蛋白质的重复冻融，对某些蛋白质来说，脱解性(NaF)是核酸、多糖、脂质等干扰分子(通过添加核糖酶或采取其他提取策略)，选择适当的分解物，正确的定量(BSA标准蛋白质)，2，除化根据不同的蛋白质大小选择不同浓度的粘合剂。制作橡胶时，要注意玻璃板必须清洁，没有残留粘合剂。将玻璃板底部展平，尽量不漏胶时，不太快，容易产生旋流水或异丙醇压力时，不太长，3，转膜a泡膜：突起前，海绵、胶水、胶片全部在预冷输送液中20min谈判者；谈判者。如果凝胶没有放在预冷薄膜缓冲区中，则在薄膜过程中会产生凝胶褶皱，使全波段变形bPVDF薄膜具有疏水性，甲醇浸泡激活，c膜顺序：阴极碳板海绵3滤片3滤海绵阳极碳板，逆d膜过程会产生大量热量。注意冷却e特定的膜时间取决于目的蛋白的大小。目的蛋白质的分子量越大，旋转时间越长，相反，短f使用镊子，避免手直接接触杂交膜。因为手里的蛋白质和油会影响膜的效率，玷污膜。，g夹膜和凝胶确定凝胶/薄膜和滤纸之间不存在气泡。否则，胶片不完全h保证胶片和滤纸的大小和凝胶完全相同。太大和太小会影响膜的效率，请注意I膜的保湿，避免膜的干燥。否则很容易产生很高的背景。4、密封的a脱脂奶粉不能与具有生物素或刀豆蛋白标记的抗体一起使用，因为脱脂奶粉中含有糖蛋白和生物素b的话，就会用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白，受到影响。如果磷酸水解酶与压印膜中的磷酸化蛋白接触，脱磷化c检测出磷酸化抗体，不能将酪蛋白/脱脂奶粉用作密封剂，5，孵化a洗涤膜尽可能注意一抗二项式清洗，有助于减少背景。b注意，一项二项力的匹配c一项二项力的效价问题，5，常见问题和解决，电泳的问题，微笑凝胶的不均匀冷却，中间冷却不好；电泳系统高温，65077条形皱眉是设备不合适的，尤其是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或两侧不完整，拖尾样品不能溶解，纹理(纵向条纹)样品有不溶性颗粒，条形偏移电极不平衡或附加位置倾斜，条带两侧扩散过度增加，西部更换适当的密封剂(脱脂奶粉、BSA、血清等)2，1项浓度过高，增加了1项稀释倍数；3、抗体孵化温度在4 时孵化温度太高，4、2抗非特异性结合，或封闭剂和交叉反应3354设定2项对照组(1项除外)，降低2项浓度5，增加洗涤数，增加洗涤数，没有阳性带或非常弱的1、1项、2项通过设置内部参数，验证二次测量系统的有效性，可以替代更好的一项二项、二项或/和二项浓度较低的抗体浓度。长孵化时间；3，如果有阻断剂和1或2项交叉反应克隆，则使用代替阻断剂(常用脱脂油、BSA、血清或明胶)的TWEEN20等软洗涤剂，4，样品中靶蛋白或靶蛋白含量设定为阳性对照组，阳性对照组有结果，但没有标本的话，靶蛋白或靶蛋白含量太大后者至少每孔20-30ug蛋白，样品准备时蛋白质酶抑制剂或分级萃取头，5，胶