3研究方法和手段

第三章细胞生物学研究方法和手段,一、显微镜技术二、细胞的分离及培养三、细胞组分的分离分离四、细胞内分子的示踪五、基本的分子生物学实验技术,第一节显微镜技术,光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。电子显微镜：以电子束为光源。,普通光学显微镜,1.构成：照明系统光学放大系统机械装置2.原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。,（一）普通光学显微镜,3.分辨力：指分辨物体最小间隔的能力。R=0.61/NANAsin/2式中：n=介质折射率；=镜口角（标本对物镜镜口的张角），N.A.=镜口率（numericaperture）。镜口角总是要小于180，所以sina/2的最大值必然小于1。思考：如何提高显微镜的分辨能力？,几种介质的折射率,显微镜的几个光学特点：制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.651.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。sin/2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为0.050.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。,荧光显微镜Fluorescencemicroscope,特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜；有两个特殊的滤光片；照明方式通常为落射式。,Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen,用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。,激光共聚焦扫描显微境Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM,用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。,laserconfocalscanningmicroscope,LCSM,LCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue),（四）暗视野显微镜darkfieldmicroscope,聚光镜中央有挡光片，照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。可观察4200nm的微粒子，分辨率比普通显微镜高50倍。,把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。环形光阑（annulardiaphragm）：位于光源与聚光器之间相位板（annularphaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。,相差显微镜,原理,用途：观察未经染色的玻片标本,偏光显微镜polarizingmicroscope,用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等。光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（与起偏器方向垂直的偏振片）。载物台是可以旋转。,淀粉,倒置显微镜inversemicroscope,物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜，有的还具有荧光装置。,电子显微镜(Electronmicroscope),1932年德国学者MaxKnolls和ErnstRuska用波长比光短得多的电子作光源,发明了第一台电子显微镜，大大提高了显微镜的分辨率，开拓了超微世界。,电子显微镜概述电子显微镜的基本结构电子显微镜基本结构由三大部分组成:电子光学系统由照明系统、标本室、成像系统、观察窗和记录用的照相机等组成；真空系统是保持电镜的真空度；电子学系统即供电系统，需要高压稳压。,以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50120KV)的平方根成反比。分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。用于观察超微结构（ultrastructure），即小于0.2m、光学显微镜下无法看清的结构，又称亚显微结构（submicroscopicstructures）。,不同光线的波长,透射电子显微镜,透射电子显微镜,TRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE，TEM,扫描电子显微镜,20世纪60年代问世，用来观察标本表面结构。工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。,Scanningelectronmicroscope（SEM）,扫描电子显微镜原理,电子染色,标本对电子的散射能力取决于其组成元素的原子序数,原子序数越高,散射的电子越多,反差就越大。生物分子是由一些原子序数很低的轻元素(氢、氧、碳、氮等)组成的,它们散射电子的能力很弱,在电镜下几乎不存在明暗反差。为使生物样品加大反差,就要进行染色,即用重金属增加电子散射能力,称为电子染色。,电镜样品的制备,制样技术,1）超薄切片电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制作。通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。,2）负染技术,用重金属盐(如磷钨酸)对铺展在载网上的样品染色；吸去染料，干燥后，样品凹陷处铺了一层重金属盐，而凸的出地方没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。,NegativeStainedActin,3）冰冻蚀刻freeze-etching,亦称冰冻断裂。标本置于干冰或液氮中冰冻。然后断开，升温后，冰升华，暴露出了断面结构。向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。,AYeastCell,第二节细胞分离和培养,一、流式细胞术,用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flowcytometer）。,二、细胞电泳,原理：在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动。各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。用途：检测细胞生理状态和病理状态、分离不同种类的细胞，如分离哺乳动物的XY精子。,三细胞培养,原代培养（primaryculture）：即：培养直接来自动物机体的细胞群，将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶，以1：2以上的比例扩大培养，称为传代或传代培养（Passage）。细胞株（cellstrain）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群。细胞系（cellline）：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，可无限繁殖。克隆（clone）：亦称无性系。指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。,实验室中常用的几种细胞系,HenriettaLacks,Americanblack,diedofcancerofuterinecervixin1951,体外细胞培养的条件环境因素无菌环境、合适的温度、一定的渗透压和气体环境、O2和CO2。后者对于维持细胞培养液的酸碱度十分重要。代谢物和废物排除：,细胞融合,通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cellfusion）或细胞杂交。同核体：相同基因型的细胞融合而成。异核体：不同基因型的细胞融合而成。自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。诱导细胞融合的方法：生物方法（仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电击和激光）。,用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程图,第三节细胞组分的分级分离,一、分离细胞亚显微结构和大分子的超速离心法,离心技术是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基本手段。转速为1025kr/min的离心机称为高速离心机。转速25kr/min，离心力89K者称为超速离心机。目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。,（一）差速离心Differentialcentrifugation,特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序：核线粒体溶酶体与过氧化物酶体内质网与高基体核蛋白体。可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心再行分离纯化。,Lowspeed,Highspeed,Differentialcentrifugation,（二）密度梯度离心,用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。类型：速度沉降、平衡沉降。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。,1、速度沉降velocitysedimentation,用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。,2.平衡沉降equilibriumsedimentation,用途：分离密度不等的颗粒。特点：介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度。所需的力场通常比速度沉降法大10100倍，往往需要高速或超速离心。原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。,Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation,可以分离蛋白质的层析法,又称色谱法在本世纪初，俄国植物学家茨维特(MTswett)将植物色素的石油醚提取液倾入装满碳酸钙颗粒的玻璃管中，再加入石油醚使其自由流下，结果植物色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的色谱带。这种方法被称为色谱法。装碳酸钙的玻璃管称为色谱柱(Column)，管内装的填料(如碳酸钙)称为固定相(Stationaryphase)，淋洗液(如石油醚)称为流动相(mobilephase)。,层析法实质上是一种物理化学分离方法：即利用混合物中各组分在两相(固定相和流动相)中溶解、析出、吸附、脱附、或其他亲和力和渗透性的差异，当两相作相对运动时，使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而得到互相分离。按两相的物态分类：用气体作流动相称为气相层析(gaschromatography简称GC)，用液体作流动相称为液相层析(1iquidchromatography，简称LC)。按固定相所处的形式分类：柱层析、纸层析、薄层层析按分离过程的物化原理分类：吸附层析法、分配层析、离子交换层析、凝胶层析法、亲和层析,离子交换层析(ionexchangechromatography)利用固定相球形介质表面活性基团经化学键合方法，将具有交换能力的离子基团在固定相上面，这些离子基团可以与流动相中离子发生可逆性离子交换反应而进行分离的方法，称之为离子交换层析。,凝胶过滤层析利用凝胶层析介质(固定相)交联度的不同所形成的网状孔径的大小，在层析时能阻止比网孔直径大的生物大分子通过。利用流动相中溶质的分子量大小差异而进行分离的一种方法，又称之为排阻层析。,亲和层析在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基，这些配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异性结合而进行分离的一种方法,疏水层析利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方法,金属螯合层析利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进行分离的方法,蛋白质电泳技术,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：最常用的变性电泳，可以用来测定蛋白质分子量。比层析法测定要好。SDS与蛋白质的疏水部分相合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。,SDS-PAGE分离蛋白,等电聚焦（isoelectricfocusing，IEF）电泳,是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。,等电聚焦电泳槽,双向电泳,第一向进行等电聚焦电泳，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离.,典型图谱,质谱技术,什么是质谱（MassSpectroscopy）气体分子或固体、液体的蒸气受到一定能量的电子流轰击或强电场作用，丢失电子生成分子离子；同时，化学键发生某些有规律的裂解，生成各种碎片离子。这些带正电荷的离子在电场和磁场作用下，按质荷比的大小分开，排列成谱，记录下来，即为质谱。,质谱分析原理图,氨基酸序列分析,Edman降解(Edmandegradation)从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。N末端氨基酸残基被苯异硫氰酸酯修饰，然后从多肽链上切下修饰的残基，再经层析鉴定，余下的多肽链（少了一个残基）被回收再进行下一轮降解循环。,全自动DNA测序仪,第五节基本的分子生物学实验技术,限制性内切酶限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA，只在原核生物中被发现切割位点有的在双链同一处切割,产生钝性末端或平滑末端;有的切割位点在双链不同处,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端,PCR,1985年KaryMullis发明了一种模拟DNA体内复制过程在体外复制特定DNA片段的的方法，命名为聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction），简称PCR。KaryMullis因此获得了1993年诺贝尔化学奖。,反应体系：样品DNA；引物（primer），约15-20个核苷酸；4种dNTP；TagDNA聚合酶，来自于嗜热水生菌Thermusaquaticus，最适作用温度7580，短时间在95下不失活。缓冲体系和Mg2+。,双链DNA在多种酶的作用下可以变性成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。标准的PCR过程分为三步：1.DNA变性（90-96）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA2.退火（25-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3.延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量增加一倍,DNA克隆,把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体克隆载体（cloningvector）。作为克隆载体的基本要求是：能进行独立自主复制；具有便于外源DNA的插入和限制酶作用的单一切割位点；必须具有可供选择的遗传标记，例如具有对抗生素的抗性基因，便于对阳性克隆的鉴别和筛选。基因工程中使用的载体基本上均来自微生物，主要包括六大类：质粒载体；噬菌体载体；柯斯质粒载体；M13噬菌体载体；真核细胞的克隆载体；人工染色体等。,将DNA插入质粒载体中,DNA测序,Sanger双脱氧法测序DNA的复制需要DNA聚合酶，4种dNTP等。聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3-OH末端，使引物延伸，合成出新的互补DNA链。如加入双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），它不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键。如存在ddCTP、dCTP和三种其他dNTP的情况下，可形成一系列长短不一片段的混合物。电泳分离制得的图谱可将全部C的位置确定下来。类似的方法可同时制得分别以ddA、ddG和ddT残基为3端结尾的三组长短不一的片段。将四组混合物平行地点加在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长