关于b基因表达产物与心肌细胞缺血损伤之间的关系及ａ药物与ｂ基因表达产物相互作用的实验1

实验设计实验目的1探究B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系。2研究在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，B基因的表达产物是否参与其中。实验原理1A药物具有保护心肌细胞免受缺血损伤的作用。2心肌细胞缺血过程中B基因的表达产物B蛋白表达量会发生改变。3冠状外慢性收缩法可逐渐导致心肌缺血，适宜多次给药和长时间进行心功能视察，更具干预价值。AMEROID缩窄环是一种内径为2025MM的双层环，外层为金属或塑料等材料，内层为酪蛋白，吸水后会膨胀，由于外层不能变形，所以酪蛋白膨胀后会向内挤压，逐渐缩窄血管内径并闭塞，造成慢性心肌缺血。4基因敲除技术可以通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失。5观察心脏组织切片中心肌细胞的形态等可推测心肌受损情况，通过ELISA检测ANP、BNP推测心肌细胞数量及受损情况。细胞凋亡/坏死检测试剂盒可以粗略描述心肌组织中凋亡/坏死的细胞数量。6CCK8法可进行细胞活性检测。CCK8试剂中含有WST8它在电子载体1甲氧基5甲基吩嗪硫酸二甲酯的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物。生成甲瓒的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450NM波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。7超声心动图是一种常用的心脏检查手段，系将超声直接作用于心脏，产生心脏解剖的影像。利用超声回波的变化曲线显示心动周期中心脏各层组织结构的活动。方法是把探头固定在与心脏对应的某部位，由于心脏有节律的收缩和扩张，心脏各层组织和探头距离也随之发生有节律的变化。它是一种无创检查技术，用于评价心脏结构，心脏功能及血流动力学指标等，该方法在医学上主要用于心血管疾病的诊断，已成为心血管疾病的首选检查方法。8通过免疫细胞化学分析BAX的表达情况可推测心肌细胞的凋亡情况，免疫细胞化学是将抗原、抗体间的免疫反应引入细胞标本，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再与标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过显色反应或荧光来显示细胞中抗原（多肽、蛋白质等），在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，籍此对细胞内某抗原作定性、定位以及定量检测。实验步骤实验一探究B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系。一动物模型的制备1B基因缺陷小鼠的制备基因敲除技术（1）构建替换型载体。（2）选取小鼠胚胎肝细胞，导入载体。（3）通过正负筛选法（PNS法）筛选重组细胞。（4）培养，杂交，以得到B基因被沉默的纯合体。2心肌缺血小鼠模型的制备取等量身体状况相近的上述B基因缺陷小鼠及正常小鼠，将B基因缺陷小鼠随机等量分组，标记为1、3组，正常小鼠随机等量标记为2、4组。取1、2组小鼠，通过手术植入AMEROID缩窄环进行LCX（冠状动脉左旋支）慢性缩窄，3、4组做假手术处理。二小鼠培养与观察将4组小鼠置于相同环境下培养若干天，并进行初步观察。三小鼠心肌受损情况分析（1）每周分别检查一次，通过超声波心动描记术分析整体心脏功能。（2）于若干天后处死，分别取4组大小厚薄相似的心脏缺血部位的心肌组织，进行如下操作1）制作石蜡切片，于光镜及电镜下分别观察4组的切片。2）用CCK8法进行细胞活性检测。3）对4组组织通过ELISA法检测ANP、BNP，进行分析。4）用凋亡/坏死检测试剂盒，使用流式细胞仪检测对4组组织进行分析，得到其凋亡/坏死情况。5）对4组组织分别进行BAX的免疫细胞化学分析。四对数据及结果进行整理分析，对心脏功能、细胞存活率、凋亡/坏死细胞数量、细胞活性、细胞形态等进行综合分析，评估心肌细胞受损的程度，进行总结讨论。预期实验结果及讨论1若1组与2组心肌受损程度存在差异，3组与4组受损程度相近，则说明B基因表达产物与心肌缺血损伤程度有关。2若1组与2组心肌受损程度相近，3组与4组心肌受损程度相近，则说明B基因表达产物与心肌缺血损伤程度无关。若上述实验结果证明B基因的表达产物与心肌细胞缺血损伤有关，则按以下方案进行实验。实验二研究在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，B基因的表达产物是否参与其中。一动物模型的制备1B基因缺陷小鼠的制备同实验一。2设置实验组以及假手术组取等量身体状况相近的B基因缺陷小鼠随机等量分别标记为1、3组，正常小鼠随机等量标记为2、4组，取1、2组小鼠，通过手术植入AMEROID缩窄环进行LCX慢性缩窄（冠状动脉左旋支），3、4组假手术处理。二给药及动物培养按照A药说明，对4组小鼠同时等量地施用A药物。将4组小鼠置于相同环境下培养若干天，并进行初步观察。三小鼠心肌受损情况分析（1）每周分别检查一次，通过超声波心动描记术分析整体心脏功能。（2）于若干天后处死，分别取4组大小厚薄相似的心脏缺血部位的心肌组织。1）制作石蜡切片，于光镜及电镜下分别观察4组的切片。2）用CCK8法进行细胞活性检测。3）对4组组织通过ELISA法检测ANP、BNP进行分析。4）用凋亡/坏死检测试剂盒，使用流式细胞仪检测对4组组织进行分析，得到其凋亡/坏死情况。5）对4组组织分别进行BAX的免疫细胞化学分析。四对数据及结果进行整理分析，通过心脏功能、细胞存活率、凋亡/坏死细胞数量、细胞活性、细胞形态等进行综合分析，评估心肌受损的程度，进行总结讨论。预期实验结果及讨论若1、2组损伤程度相近，3、4组损伤程度相近，则说明在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，B基因的表达产物不参与其中。若1、2组损伤程度有差异，3、4组损伤程度相近，则说明在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤过程中，B基因的表达产物