生物质谱 有机化合物结构鉴定与有机波普学课件

生物质谱早期有机质谱主要用于测定普通的有机小分子，对多肽、蛋白质及其他生物大分子难测定。因1分子量太大2气化高温分解。80年代后，发明了快原子轰击电离（FAB），电喷雾电离（ESI）和基质辅助激光解吸电离（MALDI）。生物大分子可转变成气相离子。产生了生物质谱。BIOMASSSPECTROMETRY有机质谱的一般应用1有机化合物的分子量和结构测定2化学反应的鉴别和反应机理的研究3石油组分和添加剂的分析4化工原料和化工产品的分析5毒品分析和中毒病人中毒品的鉴定6空气、水和泥土有机污染物的分析7香料中组分分析8食品中维生素等组分、食油中组分的分析9染料、涂料的分析10有机聚合物的分析11酒中组分的分析12植物中有机组分的分析13粮食、蔬菜、水果农药残留物的分析14烟草中组分的分析15禽肉中一些激素的分析有机质谱及其联用技术在生物医药学中的应用1天然药物结构测定，合成新药结构确证2新药中杂质、药物降解物分析，新药稳定性研究3药代动力学研究和药物代谢物结构分析4新药研究中组合化学库中组分的鉴定5多肽、蛋白质分子量的测定6多肽和重组蛋白一级结构的确定7多肽序列的测定8蛋白质变异体的检测9蛋白质中巯基测定和蛋白质中二硫键的指定10蛋白质翻译后修饰的测定11蛋白质高级结构的研究12生物分子非共价键相互作用的研究13未知蛋白质的鉴定和蛋白质组学研究14蛋白质复合物中组分的分析15寡核苷酸、DNA片段分子量测定16寡核苷酸序列分析17SNP研究18用模型识别软件快速鉴别微生物19结构免疫学研究中的应用20细胞生物学中的应用快原子轰击电离（FAB）1981原理在进样探头放样品，溶于底物（甘油或硫化甘油），惰性气体（AR）电离后，加速，使之具有较高的动能，在原子枪ATOMGUN内进行电荷交换反应AR（高动能的）AR（热运动的）AR（高动能的）AR（热运动的）高动能的AR原子束再轰击样品分子使其离子化，样品离子进入质谱。适用于难汽化,极性强的大分子。注意FAB质谱图中会出现基质分子产生的相应的峰及基质分子与样品分子的结合峰。电喷雾电离（ESI）1984用于质谱原理样品溶液从毛细管出，电场、气流使成雾状带电液滴，蒸发，液滴变小，离子从液滴出来，通过锥孔，透镜进质谱仪。20世纪90年代中期，ESI出现纳喷雾离子源（NANOELECTROSPRAYIONIZATIONSOURCE）,纳升流速，分析灵敏度提高，且少至05UL的样品溶液可得到30MIN稳定喷雾，有充分机会进行质谱参数优化和许多串联质谱分析。基质辅助激光解吸电离（MALDI）MALDI可使热敏感或不挥发的化合物由固相直接得到离子。1988原理混合物（样品加基质）真空下受激光照，基质分子能有效的吸收激光的能量，成基质离子，碰撞样品，使样品分子解吸附进入气相并得到电离，进质谱仪。MALDI适用于生物大分子，如肽类，核酸类化合物。可得到分子离子峰，无明显碎片峰。1995HILLENKAMP用MALDITOF测定短杆菌肽S合成酶，分子量为512000URNELSON用MALDITOF测定单克隆人体免疫球蛋白抗体，分子量为982000U以后RDSMITH用ESI/FTICRMS测定DNA片段，分子量为11108U应用范围生物大分子的分子量测定肽序列分析（根据其质谱中的碎片离子来推导）鉴别生物大分子的构象蛋白质中二硫键、糖基化GLYCOSYLATIONSITE、磷酸化PHOSPHORYLATION连接点用ESI观察非共价键相互作用的研究I生物大分子的分子量测定用MALDITOF测定，多数只得单电荷离子，质谱图中的谱峰与样品各组分的质量数由一一对应关系。所以MALDITOFMS最适合分析多肽及蛋白质混合物。在ESIMS时，易形成多电荷离子MNHN或MNHN。要确定电荷态。A低分辨状态下测电荷态对于任意两峰M1MN/NM2MN1/N1相邻两峰相差一个电荷数计算多电荷离子所带电荷数，进而换算出该离子带单电荷时的质量，一般根据多个多电荷峰计算多个质量后取平均值。B高分辨状态下测电荷态可分辨出单个离子峰的同位素峰，任意两峰之间质荷比的差值，计算其倒数（电荷值）。由电荷数可计算该多电荷离子的单电荷分子离子质量。II肽质量指纹谱（PEPTIDEMASSFINGERPRINTING,PMF）鉴定技术蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解，得到的肽片段质量图谱。由实验测得的蛋白质酶解肽段质量数在蛋白质数据库中检索，寻找相似肽指纹谱的蛋白质。最有效的仪器MALDITOFMS每个谱峰代表一种肽段III多肽、蛋白质、DNA片段的序列分析蛋白质的一级结构以肽链结构为基础的肽链线型序列串联质谱仪可直接测定肽段的序列，多肽被电离后，各种键会断裂，形成强度不同的离子。肽键断裂形成BN、YN系列离子。推断氨基酸连接顺序。ROEPSTORFF和FOHLMAN建议如下式A、B、C型离子保留肽链的N末端，电荷留在离子C端X、Y、Z型离子保留肽链C端，电荷留在离子N端B型和Y型离子在质谱图中较多见，丰度较高。还会BH2O和YNH3等离子形式与PMF谱图相比，串联质谱技术获取的肽序列谱图相对复杂，需计算软件帮助计算识别B、Y等个系列离子。区别肽质谱离子来自C端或N端，衍生方法N乙酰化，甲酯化分析肽序列方法FAB/CIDBOCGLYALADVALLEUILEOBZLBOCTBUTYLOXYCARBONYLBZLBENZYLH2NCNCNCNCOHR1OR2OR3OR4HHHX3Y3Z3X2Y2Z2X1Y1Z1A1B1C1A2B2C2A3B3C3H2NCOR1HH3NCCNCOHR3R4OHHB1Y“2CNH2CONH3CONH32CONHRI2H32NHC5431B1234离子类型MHMH56MH100Y4Y3Y2Y1B4B3B2B1M/Z662606562505434335222441328229158形成BN离子和YN系列离子ESI/CID十七肽NQQPLQTSGVINMKAAGGLUQLYSKB1B161152433714685817098108979541053116612801411153916101681Y”16Y”116421514138612891176104894786080370459147734621814776ESI/FTICRMS美国1994年，用MS/MS测牛胰多肽（分子量4226U）全部肽序。MALDI/PSDPSD为源后分解（POSTSOURCEDECAY）德国人RKAUFMANN提出。MPMFMNEF较E小MP为先前离子ANGIOTENSINIIASPARGVALTYRILEHISPROPHE八个氨基酸Y”1Y”7166263400513676775931B7B1881784647534371272116串联质谱法TANDEMMS（MS/MS）MS1产生待测离子（MH）进入碰撞室，经惰性气体（HE、AR）碰撞活化裂解（COLLISIONALACTIVATIONDISSOCIATION），经MS2分离得质谱图。仪器可用MALDIQTOFESITSQMALDIFTMSESIFTMS寡肽甲硫氨酸络脑菲肽ESI/MS/MS子离子谱TYRGLYGLYPHEMETMW5732Y”354229731500B425327822110检测A、B、Y系列离子十四肽谷氨酸纤维蛋白肽BESI/MS/MS子离子谱GLUGLYVALASNASPASNGLUGLUGLYPHEPHESERALGARGY”128551171310563942381326844627248043332Z103979245以Y系列为主的离子蛋白质非共价复合物的电喷雾质谱ESI/MSFORTHESTUDYOFNONCOVALENTCOMPLEXES生物大分子之间弱的非共价键相互作用，是细胞内许多生物功能实现的基础。如酶和底物、蛋白质配体、蛋白质蛋白质、抗原抗体之间的作用。药物分子发挥作用也要先与作用靶点结合再发挥功能。软电离技术离子化方式柔和，不裂解，可以分析非共价结合的生物大分子复合物，具有高分析速度和灵敏度。1）蛋白质与小分子配体相互作用肌红蛋白MYOGLOBIN与血红素HEME的结合在近中性条件下,血红蛋白169KDA与血红素616DA复合物的电喷雾质谱图显示复合物17568DA的两个多电荷峰，带9个电荷的M/Z1953，带8个电荷的M/Z21972