医学毕业论文低频低强度超声波诱导白血病细胞株k562凋亡的研究

XX大学毕业论文低频低强度超声波诱导白血病细胞株K562凋亡的研究姓名_2014年6月25日低频低强度超声波诱导白血病细胞株K562凋亡的研究作者马燕，陈宝安，吴巍，姜藻，钱梦摘要目的研究低频低强度超声波诱导白血病细胞株K562凋亡的作用及其机制。方法取对数生长期的K562细胞，分成实验组和对照组，用MTT法计算细胞存活率，流式细胞仪判断细胞凋亡，瑞氏染色和透射电镜观察细胞照射后有无出现凋亡，分光光度法检测照射前后K562细胞CASPASE3的活性改变。结果超声照射各组间细胞存活率与对照组相比有统计学差异，但组间无差异；瑞氏染色光镜下可见003W组和010W组细胞出现细胞核固缩等早期凋亡的改变，025W组出现凋亡小体等典型凋亡改变；流式细胞仪检测025W组凋亡率为3887；照射前后K562细胞CASPASE3的活性无差异。结论低频低强度超声波对白血病细胞株K562有诱导凋亡作用，与照射强度和时间无明显相关。低频低强度超声波诱导K562的凋亡可能不通过CASPASE3的途径。关键词超声；白血病细胞株K562；凋亡ABSTRACTOBJECTIVETOINVESTIGATETHEEFFECTOFLOWFREQUENCYANDLOWINTENSITYULTRASOUNDONLEUKEMIACELLLINESK562ANDTOCLARIFYTHEROLEOFCASPASE3INTHEEFFECTMETHODSK562CELLSINLOGPHASEWEREDIVIDEDINTOCONTROLGROUPANDEXPERIMENTALGROUPTHEINTENSITYOFLOWFREQUENCY20KHZANDLOWINTENSITYULTRASOUNDWERE003,010AND025WCM2RESPECTIVELYTHEEXPOSURETIMEWERE30AND60SRESPECTIVELYK562CELLSWEREINCUBATEDIN24WELLCULTUREPLATESFORDIFFERENTTIMEOFPERIODS6,24,48HAFTERSONICATIONANDTHENUMBEROFVITALCELLSWASTESTEDBYMTTASSAYTHEMORPHOLOGYOFAPOPTOSISWASANALYZEDBYWRIGHTSSTAINANDTRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPYTHEPERCENTAGEOFAPOPTOSISWERESTUDIEDBYFLOWCYTOMETRYFCMTHEACTIVATIONOFCASPASE3WASTESTEDBYCASPASE3KITWITHSPECTROPHOTOMETRICMETHODRESULTSTHEABSORBANCEVALUEOFMTTDECREASEDSIGNIFICANTLYAFTEREXPOSURETHEHIGHESTAPOPTOSISWASFOUNDIN025WGROUPAFTER30SSONICATIONAND6HINCUBATIONMORPHOLOGICALALTERATIONSOBSERVEDINCELLSAFTEREXPOSURETOULTRASOUNDINCLUDEDCELLSHRINKAGE,MEMBRANEBLEBBING,CHROMATINCONDENSATION,NUCLEARFRAGMENTATION,ANDAPOPTOTICBODYFORMATIONFCMREVEALEDTHATTHEPERCENTAGEOFAPOPTOSISOFCELLSINCONTROLGROUP,IN003WGROUP,IN010WGROUPANDIN025WGROUPWAS760,3595,1157AND3887RESPECTIVELYTHEREWERENOSIGNIFICANTDIFFERENCEOFACTIVATIONOFCASPASE3BETWEENCONTROLANDEXPERIMENTALGROUP025WGROUPAFTER30SSONICATIONAND6HINCUBATIONCONCLUSIONLOWFREQUENCHYANDLOWINTENSITYULTRASOUNDCANINDUCEAPOPTOSISINK562CELLLINESAFTERTHEEXPOSURETHEEFFECTISNOTRELEVANTTOTHEINTENSITYANDEXPOSURETIMEOFULTRASOUNDKEYWORDSULTRASOUND；MALIGNANTMYELOIDCELLLINESK562；APOPTOSIS超声是一种机械波，对正常组织损伤小，而其诱导肿瘤细胞凋亡已有许多报道13。大部分研究集中于高频超声的杀伤作用46，目前高聚焦超声HIFU已用于临床7。低频超声相对于高频超声对周围组织损伤更小，能够抑制细胞生长和克隆形成，方向性好，并能增强化疗药物的作用，已成为研究热点810。本实验用低频超声波对白血病细胞株K562进行照射，研究不同剂量低频超声波对白血病细胞株K562的作用，为低频超声治疗的临床应用提供实验数据。1材料和方法11材料111细胞K562白血病细胞株,由上海血液研究所提供,第一作者所在实验室常年培养。112实验仪器东南大学江苏铁医美达康医疗器械厂生产的NTY300A型低功率超声肿瘤治疗仪简称治疗仪，输出功率0150，可调。113主要试剂MTT购于SIGMA公司，ANNEXIN购于BD公司，CASPASE3试剂盒购于南京凯基生物公司（进口分装），BCL2/BAX试剂盒购于上海生工生物工程有限公司。12方法121细胞培养K562细胞接种于含10小牛血清的1640培养液中，置于37、5的CO2培养箱中，每23D传代1次，试验时取对数生长期细胞。122超声照射将处于对数生长期的K562细胞取出，离心后置24孔培养板中，RPMI1640培养液重悬，调细胞浓度为5105ML1。分成对照组与实验组，实验组选取不同声强（003、010、025WCM2）、不同时间30、60、120S的超声辐射进行干预。123MTT法计算细胞存活率将不同照射组以及对照组的细胞取出，分别计数，培养液稀释至2105ML1，置于96孔板中，每孔100L；每组设3个复孔，向每孔加入MTT液10L（浓度为5GML1），于37、5的CO2培养箱中孵育4H，1500RMIN1平板离心10MIN；弃上清后加入二亚甲砜（DMSO）100L孔1，振荡10MIN，待沉淀完全溶解后于550NM处在酶标仪上测吸光度（A）。按下式计算细胞存活率细胞存活率（）A实验孔/A对照孔100。124流式细胞仪检测收集不同照射组和对照组K562细胞1106个，冷PBS洗涤2遍后，用501ANNEXIN结合缓冲液悬浮细胞，加ANNEXINFITC5，室温避光放置10MIN,再加PI10,混匀后室温避光放置5MIN，冷PBS洗涤1遍，加3001ANNEXIN结合缓冲液重悬细胞后，立即在流式细胞仪BECTONDICKINSON上检测，以ANNEXIN/PI判断为早期凋亡,ANNEXINPI判断为晚期凋亡。125CASPASE3的检测收集细胞，用PBS洗涤细胞2次，2000RMIN1离心5MIN，收集细胞（35）106ML1，用50冰冷的LYSISBUFFER悬浮细胞，置冰上20MIN；410000RMIN1离心3MIN，把离心上清转移到新的离心管中，并放置冰上；标准曲线法测定蛋白浓度，吸取50含50200G蛋白的细胞裂解上清；再加50的2反应液，再加5CASPASE3底物，并避光孵育4H，用酶标仪或分光光度计在405NM或400NM处测定其吸光值；通过计算OD试验组/OD对照组值确定凋亡组的CASPASE3活化程度。126瑞氏染色将干燥好的玻片平置染色架上，滴加染液（液）35滴，使其迅速盖满玻片，1MIN后滴加等量的缓冲液（液），轻轻摇动玻片使染液充分混合，20MIN后用流水冲去染液，待干，置于显微镜下观察。127透射电镜观察收集不同照射组的细胞，移入10ML玻璃离心管中，加4预冷的PBS001MOLL1，PH72至10ML，用吸管轻轻吹打均匀，2000RMIN1离心20MIN,弃上清。离心管倾斜一定角度，沿管壁缓慢加入4预冷的2戊二醛，送电镜室。13数据处理采用SPSS120统计软件分析。2结果21MTT法检测结果003W照射30S培养6H组和01W照射30S培养6H组细胞存活率较对照组明显降低（表1）。同一照射强度不同照射时间不同培养时间组细胞存活率无明显差异，但与对照组相比有统计学差异。表1低频低强度超声不同照射时间、照射强度组K562细胞的存活率（略）22流式细胞仪检测结果对照组及003、010、025W照射30S孵育6H的各实验组K562细胞凋亡率依次为760、3595、1157、3887，各实验组与对照组比较差异均显著（图1）。23分光光度法检测结果025W照射30S培养6H和照射前比较，均OD照射后/OD照射前1（3次分别为0992、0989和0993），K562细胞CASPASE3的活性照射前后无明显改变。24瑞氏染色结果003W照射30S培养6H组（图2E）和010W照射30S培养6H组（图2F）细胞出现细胞核固缩、染色质边集等早期凋亡的改变；025W照射30S培养6H组细胞出现细胞核破碎，可见凋亡小体等典型凋亡改变（图2G、H）。25透射电镜结果003W照射30S培养6H组（图3I）和010W照射30S培养6H组（图3J）细胞出现细胞核固缩、染色质边集的早期凋亡改变；025W照射30S培养6H组细胞出现核碎裂，可见凋亡小体的典型凋亡改变（图3K、L）。A对照组B003W照射30S孵育6HC010W照射30S孵育6HD025W照射30S孵育6H图1流式细胞仪检测结果（略）FIG1THERESULTOFTHEPERCENTAGEOFAPOPTOSISBYFLOWCYTOMETRYFCM图2瑞氏染色结果（10010，箭头指示凋亡细胞）（略）FIG2THEMORPHOLOGYOFAPOPTOSISBYWRIGHTSSTAIN（10010）图3透射电镜图（略）FIG3THEMORPHOLOGYOFAPOPTOSISBYTRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPE3讨论超声的生物学效应包括空化效应、热效应和机械效应三方面11。已有报道超声对肿瘤细胞的作用与空化作用有关12。ASHUSH等13报道用750KHZ超声照射白血病细胞株K562、HL60和U937，结果为超声通过空化效应使细胞膜、DNA、线粒体及其他细胞结构损伤，从而诱导细胞凋亡。本实验用20KHZ不同强度的低频超声照射K562细胞株，出现明显凋亡，提示低频超声对K562细胞株有致凋亡作用，国内外尚无相关报道，但低频超声诱导K562凋亡的超声机制有待进一步研究。细胞凋亡的特点是程序性死亡，是机体的一种正常生理现象和保护机制14。相反，细胞的快速死亡往往会对机体产生不利影响。因此，肿瘤的治疗倾向于诱导肿瘤细胞凋亡而不是快速致死。各种因素诱导细胞凋亡后，凋亡事件发生呈以下顺序激活受体，细胞色素C/APAF1复合体生成，线粒体功能减退，CASPASE家族活化，磷脂酰丝氨酸暴露，细胞形态改变，DNA断裂片断出现15。根据细胞凋亡事件发生的顺序，本研究观察了不同剂量低频超声辐照后K562细胞中CASPASE3活性的改变。CASPASE家族属于天冬氨酸蛋白酶，在正常状态下都以无活性的酶原形式表达。当细胞发生凋亡时，一些CASPASE活化后依次激活其他CASPASE，形成级联反应，促发细胞凋亡。CASPASE家族中，以CASPASE3、8、9与凋亡的关系最为密切，在细胞凋亡中期执行凋亡的作用。本研究结果显示，低频超声照射前后CASPASE3的活性无明显改变，提示低频超声诱导K562凋亡的分子机制不是通过CASPASE3的途径，可能通过CASPASE家族中其他酶的途径，如CASPASE8、CASPASE9等，也可能不通过CASPASE途径诱导凋亡。细胞凋亡是一个多因素、多通路参与的过程，不能只根据单一指标来判断凋亡，并且，凋亡细胞不同时间出现的凋亡事件不同，而每个指征维持有一个时间段，因此，在今后的研究中，还需要进行多指标同时检测，在不同的时间点进行采样，从而保证检测结果的准确性。本研究在离体细胞中进行，关于低频超声对人体内K562细胞的效应，还有待进一步的研究。参考文献1杨志宏,王智彪,于廷和低频超声对卵巢癌COC1细胞增殖和凋亡的影响J肿瘤防治研究，2004,3152492512LAGNEAUXL，DEMEULENAEREC,DELFORGEA,ETALULTRASONICLOWENERGYTREATMENTANOVELAPPROACHTOINDUCEAPOPTOSISINHUMANLEUKEMICCELLSJEXPHEMATOL,2002,3011129813013潘长穿,陈文卫,石华低频超声对MOLT4肿瘤细胞的生物学效应J中国医学影像技术,2004,2011167016724高尚梅,赖春冬,王智彪高强度聚焦超声致培养肿瘤细胞的温升效应J中国超声医学杂志,2001，171465朱学强,伍烽,周强高强度聚焦超声治疗乳腺癌后局部TIL的细胞毒效应分子表达的研究J实用医院临床杂志,2004，1321236王琳,杨爱珍,梁凤萍高强度聚焦超声对体外培养人肝癌细胞的作用J临床肿瘤学杂志,2004，921491547TERHAARGRHIGHINTENSITYFOCUSEDULTRASOUNDFORTHETREATMENTOFTUMORSJECHOCARDIOGRAPHY,2001,1843173228OGAWAK,TACHIBANAK,UCHIDAT,ETALHIGHRESOLUTIONSCANNINGELECTRONMICROSCOPICEVALUATIONOFCELLMEMBRANEPOROSITYBYULTRASOUNDJMEDELECTRONMICROSC,2001，34（4）2492539TOMIZAWAM,EBARAH，SAISHOS，ETALIRRADIATIONWITHULTRASOUNDOFLOWOUTPUTINTENSITYINCREASEDCHEMOSENSITIVITYOFSUBCUTANEOUSSOLIDTUMORSTOANANTICANCERAGENTJCANCERLETT,2001，173313510NELSONJL,ROEDERBL,CARMERJC,ETALULTRASONICALLYACTIVATEDCHEMOTHERAPYDRUGDELIVERYINARATMODELJCANCERRES,2002，627280728311LIF,KONDOT,ZHAOQ,ETALENHANCEMENTOFHYPERTHE