[硕士论文精品]四步灌流法分离肝细胞的实验研究

浙江戈擘硕士荦位论文同等学力四步灌漉法分离肝细胞的实验研究中文摘要四步灌流法分离肝细胞的实验研究中文摘要研究背景肝细胞属于高度分化的多功能、实质性脏器细胞。肝细胞离体后，在不适宜环境中很快出现低功能、去分化甚至死亡，如缺少肝细胞生长因子HGF、表皮生长因子EGF等引起细胞衰老和失功能，PH值不适和无激素支持导致细胞死亡，基因的激活造成细胞凋亡等。随着近代细胞工程学的进展，细胞生物学、组织培养技术、生物学技术的最新成就，肝细胞作为构建生物人工肝的生物部分，作为细胞移植治疗急慢性肝衰竭的种子细胞以及作为药物筛选的靶细胞，成为目前研究的热点，而制备和培养大量的、高质量的肝细胞是这些研究的最基本环节。肝细胞分离方法有多种机械分离法、螯合法和酶消化法等。最初的机械分离法始于半个多世纪前，1956年SORRENTINO第一次用机械的方法把新鲜肝组织制成匀浆，并在体外进行药物解毒试验，证实了它有代谢水杨酸、巴比妥钠、酮体的能力，同时还证实了它能够利用氨合成尿素但机械分离法获得的肝细胞，细胞数量少、活性差，现已很少被使用。1967年HOWARD创建了胶原酶灌流法，后经BERRY和FRIEND等人的改良，采用无钙的平衡盐、胶原酶和透明质酸酶配制成的消化液进行灌流，获得的肝细胞的数量和活性均优于机械分离法。1972年SEGLEN进一步将这种方法发展为两步灌流法，即首先灌注预热的无钙平衡盐溶液，以去除肝血窦内的血细胞及部分非实质细胞，然后再灌注含有胶原酶的平衡盐溶液，进行体外消化后，分离提纯而获得肝细胞。用此法获得的肝细胞，细胞数量和活性都得到了提高，而且减少了肝细胞悬液中的杂质肝细胞的二步灌流法也成为目前实验室常用的方法。二步灌流法适合中小型动物如小鼠、大鼠、兔及犬等动物肝脏的分离。猪的肝脏因含有更多的胶原及纤维组织，人的肝脏体积较大，用二步分离法分离效果不佳。而生物人工肝和细胞移植等研究需要大规模制备高质量肝细胞。因此建立从猪等较大动物脏器和人肝脏分离肝细胞的细胞分离技术成为必需。本研究以二步灌流法为对照，建立四步灌流的新方法，为获得高质量的肝细胞提供新途径。L浙江大擘项士学位论文同等擘力四步灌流法分离肝细胞的实验研究中丈摘要材料和方法中性蛋白酶DISPASE、DNA酶1NASE和牛血清白蛋白BSA购自美国罗氏公司；型胶原酶TYPEIVCOLLAGENASE、谷胺酰胺GLUTAMINE购自美国SIVA公司；WALLI鲫SE购自美国GIBCO公司；葡萄糖GLUCOSE、羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES、碳酸氢钠NAHC03、氯化钠NACL、氯化钾ZCL、磷酸二氢钾ZH,POD、磷酸氢二钠NA2HPO,7HO、氯化钙CACL2H。0、台盼蓝、氯化镁MGCL26H0、硫酸镁MGS047H劫、胰蛋白酶TRYPSIN和乙二胺四乙酸EDTA4NA购自上海生物工程技术公司公司；胎牛血清FBS购自美国HYCLONE公司；肝素购自上海第一生化药业有限公司；培养瓶和培养板为丹麦NUNC公司产品；022UM过滤器为德国MILLIPORE公司产品。中国小型猪购自北京农业大学实验猪场。实验仪器包括OLYMPUS倒置相差显微镜、日本HITACHIH600A透射电镜、美国FORMA氧化碳培养箱、美国THERMO液氮储存罐、德国SARTORIUS酸度计和电子天平、德国MILLIPORE超纯水仪、德国SCOTSMAN制冰机、日本HITACHI立式大容量低温离心机、日本TOMY蒸汽消毒锅、德EPPENDORF蠕动泵、上海精宏实验设备有限公司电热恒温水浴箱、杭州仪表电机厂磁力加热搅拌器等，80目和150目不锈钢网筛购自华东医药股份有限公司，体外灌流装置自行设计。无菌手术取中国小型猪肝脏，用含EDTA、胶原酶等灌流液进行常规的体外二步灌流法分离猪肝细胞。同样方法取肝后，将肝脏放在不锈钢盆中，轻轻挤压肝脏，用4预冷的灌流缓冲液PB500RAL尽可能多地冲洗去肝脏外部血液和大血管中残留的血液。第一步经蠕动泵向肝脏中连续灌注常温的含EDTA的灌流缓冲液PBE300ML、预热至39“C的PBE液700ML,第二步灌注预热至39“C的含HEPES的PB液500ML；弃去上述灌流液，将肝脏转于新的无菌不锈钢盆中，第三步灌注预热39的含DISPASE的灌流缓冲液PBD500IIIL，第四步弃去其中约200RAL灌流液，继续用预热至39的含胶原酶的灌流缓冲液PBC500RAL灌流，这500MLPBC液和约30胁1的PBD液重复循环灌注，直至肝包膜分离；摘除胆囊，锐性撕裂肝包膜，去除纤维结缔组织，在冰浴条件下用80目和150目不锈钢网筛过滤肝细胞，收集肝细胞悬液。洗涤两种灌流法收集的肝细胞，台盼蓝染色，计算肝细胞的活率和得率。用2浙江大擘硕士学位论文同等学力四步灌流法分离肝细胞的实验研充中史摘要WILLIAMSMEDIUME培养肝细胞，计算肝细胞24H贴壁率。结果采用自行设计的体外灌流系统，对中国小型猪肝脏进行常规的胶原酶两步灌流和我们创建的四步灌流法分离肝细胞。二步法分离肝细胞的活率是885，后者为954；二步法分离得到的肝细胞总数是31O7X107克肝组织，四步灌流法所得的分离细胞总数为53511107克肝组织；二步灌流法分离的肝细胞贴壁率为80，四步灌流法获得的肝细胞贴壁率达90以上。四步分离法分离得到肝细胞的活率、得率和24H贴壁率显著高于二步灌流法P以05，且细胞碎片和其它非实质细胞污染极少，镜下观察非实质细胞污染率低。结论四步灌流法分离肝细胞，可获得更高的细胞活率和得率，对于培养后的细胞贴壁也有明显促进作用，且细胞碎片和其它非实质细胞污染极少。该法可广泛应用于生物人工肝用肝细胞的分离和其他大规模分离肝细胞的研究。为生物人工肝、细胞移植和药物筛选等研究提供高质量的肝细胞。关键词肝细胞；灌流法；分离；细胞培养鳖擘塑芏堡垒文同等学力四步灌流法分离肝细胞的实验研究英文摘要ANEW4STEPPERFUSIONTECHNIQUEFORMASSHEPATOEYTEISOLATIONABSTRACTBACKGROUNDHEPATOCYTEBELONGSTOASORTOFHIGHDIFFERENTIATEDPARENCHYMALCELLWITHMULTIPLEFUNCTIONSITMAYCHANGEGRADUALLYTOBEOFHYPOFUNEFION,DEDIFFERENTIATIONANDEV肌DEATHRAPIDLYUNDERTHEINAPPROPRIATEENVIROMENTNVITRO，FORINS咖，ABSENCEOFHEPATOEYTEGROWTHFACTORHODANDEPIDERMALGROWTHFACTOR饵GF啪CAUSECELLSENESCENCEANDNONFUNCTION，INAPPROPRIATEPHVALUEANDLACKOFHORMONECANCARLSECELLDEATH,ANDGENEACTIVATION啪CAUSEAPOPTOSISWITHTHEDEVELOPMENTOFMODEMCELLENGINEERINGANDTHELATESTACHIEVEMENTSINEYTOBIOLOGY,TISSUECULTURETECHNIQUEANDBIOLOGY,NOWADAYSHEPATOCYTEHASBECOMETHEHOTSPOTOFMULTIPLESTUDIESBECAMEITCANBEUSEDASTHEBIOLOGICALSECTIONINTHECONSTRUCTIONOFBIOARTIFICIALLIVER,THESEEDCELLINCELLULARTRANSPLANTATIONTOCUREACUTEANDC11ROMCLIVERFAILUREANDTHETARGETCELLINTHEDRUGSCREENINGTHUS，THEPREPARATIONANDCULTUREOFALARGENUMBEROFHIGHACTIVEHEPATOEYTESHAVEBECOMETHEMOSTBASICLINKAMONGALLTHESESTUDIESTHEREAREMANYKINDSOFHEPATOCYTEISOLATIONMETHOD,SUCHASMECHANICALSEPARATION,CHELATION,ENZYMEDIGESTION,AND80ONTHEMECHANICALSEPARATIONBEGANMORETHANHALFACENTURYAGOIN1956，FORTHEFIRSTTIME，SORRENTINOPREPARED舶SHHEPATICTISSUEHOMOGENATEUSINGMECHANICALMETHODANDMANYINVIVODRUGDETOXIFICATIONTRIALSWEREPERFORMEDITWASDEMONSTRATEDTHATTHEHOMOGENATECOULDDIGESTSALICYLICACID,BARBITALSODIUMANDKETONEBODY,ANDINDUCETHEUREASYNTHESISOFAMMONIAGRADUALLY,THISMETHODWASABANDONEDBECAUSEOFALITTLENUMBEROFHEPATOCYTESWITHPOORMOTILITYIN1967，HOWARDESTABLISHEDCOLLAGENASEPEFFUSIONMETHODTHATWASTHENIMPMVCDBYBERRYANDFRIENDUSINGTHEPERFUSIONOFDIGESTIVEFIQUIDTHATWASPREPAREDTHROUGHBALANCEDSALINEWITHOILTCALCIUM,COLLAGENASEANDHYALURONIDASE,THEMETHODCOULDYIELDALARGERNUMBEROFHEPATOCYTESWITHBETTERMOTILITYTHANTHEMECHANICALSEPARATIONIN1972,SEGIENFURTHERDEVELOPEDTHEMETHODINTOTWOSTEPPEFFUSION,DURINGWHICHTHEPREHEATEDBALANCEDSALINEWITHOMCALCIUM4浙江大学硕士擘住论文同等学力】四步灌泷法分离肝细胞的实验研究荚文摘要WASFIRSTINFUSEDTOREMOVEBLOODCELLSWITHINHEPATICSINUSOIDANDSOMENONPARCNCHYMALCELLS，ANDTHENBALANCEDSALINECONTAININGCOLLAGENASEWASINFUSEDTOPERFORMINVITRODIGESTIONFOLLOWINGTHESEPROCEDURES，HEPATOCYTEWASSEPARATED，PURIFIEDANDOBTAINEDBYTHISMETHOD，THENUMBEROFHEPATOCYTCANDITSMOTILITYWOIEBOTHIMPROVEDANDFOREIGNMATTERSINHEPATOC”ESUSPENSIONWEREREDUCEDNOWADAYS,THETWOSTEPPCRFUSIONHASBECOMEONECOMMONMETHODUSEDINTHELABORATORYHOWEVER,TWOSTEPPERFUSIONRNCTHODISAPPROPRIATEINLIVERSEPARATIONOFSMALLANIMALSSUCHASMICE，RATS，RABBITSANDDOGS，ANDTHEEFFECTIVENESSOFSEPARATIONISPOORINPIGSBECAUSEOFTHEMORECOLLAGENSANDFIBROUSTISSUEINLIVERSNEVERTHELESS，ALARGENUMBEROFHIGHQUALITYHEPATOCYTESARENEEDEDINBIOARTIFICIALLIVERANDCELLULARTRANSPLANTATIONSTUDIESTHEREFORE,ITISNECESSARYTOESTABLISHNOVELCELLSEPARATIONTECHNIQUESFROMLARGEANIMALORGANSIEPIGANDHUMANLIVERSINTHECURRENTSTUDY,WIMTWOSTEPPERFUSIONCONTR01WEESTABLISHEDANOVELFOURSTEPPEFFUSIONMETHODINORDERTOPROVIDENEWAPPROACHESTOOBTAININGHIGHQUALITYHEPATOCYTESMATERIALSANDMETHODSTHEFOLLOWINGMATERIALSWEREOBTAINEDCOMMERCIALLYDISPASE，DNASEANDBOVINESERUMALBUMINBSAWEREPURCHASEDFROMROCHEHOLDINGAGUSA；TYPECOLLAGENASEANDGLU伽NINEWEREFROMSIGMACORPORATIONOFUSA；WALLIAMSEWASFROMGIBCOCORPORATIONOFUSA；GLUCOSE，HCPES，NAHC03，NACI，KCLKH2P03,NA2IIP047H20，CACL22H207TRYPENBLUE，MGCL26H20，MGS047H20，TRYPSINANDEDTA4NAWEREFROMSHANGHAIBIOENGINERINGCO，LTD；FETALBOVINESERUMA限SWASFROMHYCLONECORPORATIONOFUSAANDHEPARIN删FROMSHANGHAINO1BIOCHEMICALPHARMACEUTICALCO。，LTDCULTUREFLASKANDCNITUREPLATEWEIEFROMNUNCCORPORATIONOFDENMARKFIL仃ATOK022ILN1WASFROMMILLIPUREULTRAPUREWATERSYSTEMOERMANYCHINESEEXPERIMENTALMINIATUREPIGSWEPURCHASEDFROMTHEEXPERIMENTALHOGPENOFCHINAAGRICURURALUNIVERSITYEXPERIMENTALINSTRUMENTSINCLUDEOLYMPUSINVERTEDPHASECONTRASTMICROSCOPE,H600ATRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPEHITACHI，JAPAN，C02INCUBATORFFORMA5渐江大学顶士学位论文同等学力四步灌流法分离肝细胞的实验研究英文摘要SCIENTIFIC，USA，LIQUIDNITROGENTANKOHERMOSCIENTIFIC，USAAEIDOMETERANDELEELRONIEBALANCESARTORIUS，GERMANY，MILLIPOREULTRAPUREWATERSYSTEMOERMANY，ICEMACHINESCOTSMAN,GERMANY，LARGECAPACITYREFRIGERATEDCENTRIFUGEHITACHI，JAPAN，VAPORSTERILIZATIONMACHINETOMY,JAPAN，PERISTALTICPUMPEPPENDOFF；GERMANY，ELECTROTHERMALTHERMOSTATICWATERBATHBOXSHANGHAIJINGHONGLABORATORYINSTRUMENTCO，LTDANDHEATINGMAGNETICSTIRREROTANGZLAOUINSTRUMENIANDELECTRICALMACHINERYFACTORYSTAINLESSSTEELWIREMESH伴80AND150WELEPURCHASEDFROMHUADONGMEDICINECO，LTDANDTHEEXTRAEORPOREALPCRFUSIONAPPARATUSWERESELFDESIGNEDPORCINEHEPATOEYTESEPARATIONW私PERFORMEDUSINGPERFUSATCCONTAININGEDTAANDEOLLAGENASEACCORDINGTOTHEROUTINETWOSTEPPERFUSIONMETHODINVITROLIVERWASOBTAINEDBYTHESAMEMETHODANDPUTINSTAINLESSSTEELPOT,ANDTHENWASCRUSHEDGENTLYBLOODOUTSIDETHELIVERANDRESIDUALBLOODINGREATVESSELSWEREWASHED嬲MUCH懿POSSIBLEUSING500MLPEFFUSIONBUFFERPBPRECOOLEDAL4FIRST,LIVERWILLSCONSECUTIVELYINFUSEDWITH300MLPERFUSIONBUFFERWITHED呵APBEWITHNORMALTEMPERATUREAND700MLPBELIQUIDPREHEATED缸3912THROUGHPERISTALTICPUMPSEEONCK500MLPBLIQUIDPREHEATEDAT39W器INFUSEDINTOLIVERANDTHENWASREMOVEDTHENFIVERWASTRANSFERREDINTOANEWSTERILESTAINLESSSTEELPOTTHIRD,500MLPERFUSIONBUFFER、析TLIDISPASEPBDPREHEATEDAT39WASINFUSEDFOURTH,ABOUT200MLPERFUSATEWASREMOVEDANDTHEN500MLPERFUSIONBUFFERWITHCOLLAGENASEPBCPREHEATED破39ISINFUSEDTHE500MLPBCLIQUIDANDTHERESIDUAL300MLPBDH删DWEINFUSEDINTHERECYCLINGWAYUNTILLIVERCAPSULEWASSEPARATEDCHOLEEYSTWASREMOVEDANDLIVERCAPSULEWASSHARPLYTORNFIBROUSEORMEETIVETISSUEWASREMOVEDANDHEPATOEYTE佻OBTAINEDUNDERTHEICEBATHTHROUGH80AND150STAINLESSSTEELWIREMESH,ANDTHENHEPATOEYTESUSPENSIONWASCOLLECTEDHEPATOEYTEWASCOLLECTEDVIATHETWODIFFERENTPERFUSIONMETHODSANDWASSTAINEDUSINGTRYPANBLUEMOTILITYANDRECOVERYRATES眦CALCULATEDHEPATOCYTEWASCULTUREDUSINGWILLIAMSMEDIUMEAND24LAADHERENTRATEOFLAEPATOEYTESWASCALCULATED6浙江大学硕士学位论文同等擘力四步灌流法分离肝细胞的实验研究正文RESULTSUSINGSELFDESIGNEDEXTRAEORPOREALPERFNSIONSYSTEM，HEPATOCYTEWASPARATCDFIOMMINIATUREPIGVIATHEROUTINETWOSTEPPERFUSIONANDTHEFOURSTEPPERFNSIONMETHODWEHADESTABLISHED,RESISTIVELYTHEHEPATOEYTEMOTILITYRATEW豁885AND95士4INTWOANDFOURSTEPMETHODSRCSPEETIVDYTHETOTALNUMBEROFSEPARATEDHEPATOCYTESWAS31士07X107GHEPATICTISSUEAND53411X107佗HEPATICTISSUE，RESPECTIVELYTHEADHERENTRATEOFHEPATOCYTEWAS80ANDHIGHERTHAN90，RESPECTIVELYTHEREWERESIGNIFICANTLYHIGHERHEPATOEYTEMOTILITYANDRECOVERYRATESAND24HADHERENTRATEINTHEFOURSTEPMETHODASCOMPAREDWITHTHETWOSTEPMETHODP005，WITHEXTREMELYLITTLECELLULARFLACTIONSANDNONPARENCHYMALCELLCONTAMINATIONUNDERTHEMICROSCOPE，THECONTAMINATIONRATEOFNONPARENCHYMALCELLSWASLOW。CONELUSIONFOARSTEPPERFNSIONMETHODCALLRESULTINHILGHHEPATOCYTEMOTILITYANDRECOVERYRATES，ANDSIGNIFICANTLYIMPROVETHEADHERENCEABILITYOFCULTUREDCELLSFURTHERMORE,THEREALEEXTREMELYLITTLECELLU1ARFRACTIONSANDNONPARENCHYMALCELLCONTAMINATIONTHISMETHODMAYBEEXTENSIVELYUSEDDURINGSEPARATINGHEPATOEYTEFORBIOARTIFICIALLIVERANDINOTHERLARGESTUDIES011HEPATOCYTESEPARATIONITCANPROVIDEHI曲QUALITYHEPATOEYTESINBIOARTIFICIALLIVERANDCELLULARTRANSPLANMFIONSTUDIESKEYWORDSHEPATOCYTE；PERFUSION；ISOLATION；CELLCULTURE7浙江走学硕士学位论文同等学力四步灌流法分离肝细胞的实验研究正史四步灌流法分离肝细胞的实验研究研究背景正常肝脏具有生物合成和转化功能，参与糖、脂肪和蛋白质三大物质代谢、分泌具有促进肝细胞生长的活性物质、清除毒性物质及机体中间代谢产物，并且具有免疫功能。肝细胞属于高度分化的多功能、实质性脏器细胞。肝细胞离体后，在不适宜环境中很快出现低功能、去分化甚至死亡，如缺少肝细胞生长因子HGF、表皮生长因子EGF等引起细胞衰老和无功能，PH值不适和无激素支持导致细胞死亡，自杀基因的激活造成细胞凋亡等。随着近代细胞工程学的发展，细胞生物学、组织培养技术、生物学技术的最新成就，肝细胞作为构建生物人工肝的关键部分一一生物部分，作为细胞移植治疗急慢性肝衰竭的种子细胞以及作为药物筛选的靶细胞，成为目前研究的热点，而制各和培养大规模的、高活力的肝细胞是这些研究的最基本环节。肝细胞分离方法有多种机械分离法、螯合法和酶消化法等。最初的机械分离法始于半个多世纪前，1956年SORRENTINO第一次用机械的方法把新鲜肝组织制成匀浆，并在体外进行药物解毒试验，证实了它有代谢水杨酸、巴比妥钠、酮体的能办，同时还证实了它能够利用氨合成尿素。但机械分离法获得的肝细胞，细胞数量少、活性差，逐渐被弃用。1967年HOWARD创建了胶原酶灌流法，后经BERRY和FRIEND等人的改良，采用无钙的平衡盐、胶原酶和透明质酸酶配制成的消化液进行灌流，获得的肝细胞的数量和活性均优于机械分离法。1972年SEGLEN进一步将这种方法发展为两步灌流法，即首先灌注预热的无钙平衡盐溶液去除肝血窦内的血细胞及部分非实质细胞，然后再灌注含有胶原酶的平衡盐溶液进行体外消化后，分离提纯而获得肝细胞。用此法获得的肝细胞，细胞数量和活性都得到了提高，而且减少了肝细胞悬液中的杂质。肝细胞的二步灌流法也成为目前实验室常用的方法。但二步灌流法适合中小型动物如小鼠、大鼠、兔和犬等动物肝脏的分离。猪的肝脏因含有更多的胶原及纤维组织，用二步分离法分离效果不佳。而生物人工肝和细胞移植等研究需要大规模制备高质量肝细胞。因此建立从猪等较大动物脏器和人肝脏分离肝细胞的细胞分离技术成为必需。本研究以二步灌流法为对照，建立四步灌流的新方法，为获得高质量的肝细胞进行生物人工肝、细胞移植等研究提供技术保障。8浙江大擘硕士学位论文同等学力四步灌流法分离肝细胞的实验研究正丈一材料材料和方法1、试剂氯化钠NACL氯化钾KCL碳酸氢钠NAHC03磷酸二氢钾KHP03磷酸氢二钠NA2HPO,7H20葡萄糖GLUCOSE乙二胺四乙酸EDTA4NA氯化钙CACL。2H劫氯化镁MGCI6H。O硫酸镁MGSO,7HO羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES胰蛋白酶TRYPSIN中性蛋白酶DISPASEDNA酶DNASE牛血清白蛋白BSA型胶原酶TYPEIVCOLLAGENASE谷胺酰胺GLUTAMINE胎牛血清FBSWALLI鲫SE培养基盐酸氯胺酮肝素台盼蓝上海生物工程技术公司公司上海生物工程技术公司公司上海生物工程技术公司公司上海生物工程技术公司公司上海生物工程技术公司公司上海生物工程技术公司公司上海生物工程技术公司公司上海生物工程技术公司公司上海生物工程技术公司公司上海生物工程技术公司公司上海生物工程技术公司公司上海生物工程技术公司公司美国ROCHE公司美国ROCHE公司美国ROCHE公司美国SIGMA公司美国SIGMA公司美国HYCLONE公司美国GIBCO公司上海第一生化药业有限公司上海第一生化药业有限公司上海生物工程技术公司公司9浙江大擘项士学位论文同等学力四步灌流法分离肝细胞的实验研究正文2、实验材料培养瓶培养板022UM过滤器中国小型猪3、实验仪器倒置相差显微镜透射电镜二氧化碳培养箱超纯水仪制冰机大容量、低温离心机蠕动泵美国THERMO液氮储存罐SARTORIUS酸度计电子天平蒸汽消毒锅电热恒温水浴箱磁力加热搅拌器80目、150目不锈钢网筛丹麦NUNC公司丹麦NUNC公司德国T4ILLIPORE公司北京农业大学实验猪场日本OLYMPUS日本HITACHI美国FORMA德国MILLIPORE德国SCOTSMAN日本HITACHI德国EPPENDORF美国THEMO德国SARTORIUS德国SARTORIUS日本TOMY上海精宏实验设备有限公司杭州仪表电机厂华东医药股份有限公司4、实验试剂的配制1含EDTA的DHANKS液的配制称取NACI89，KCL049，KH,PO,006G，NAHCO,0359，NA棚地7H,O0099，即TA4NA0209，充分溶解后，加超纯水定容至1000ML，调整PH值至74022M过滤器过滤除菌。4Z保存备用。2含胶原酶的HANKS液的配制称取KCL0409，KH2P03006G，MGCI,6H200109，MGSO,7H200109，CACLL0149。NACI8OOG，NAHCO，0359，NAJIPO,7H200099。GLUCOSEIOOG，充分溶解后，加超纯水定容至1000ML，10浙江大擘硕士擘住论文同等擘力四步灌流法分离肝细胞的实验研究正文调整PH值至74，此为HANKS液。022NM过滤器过滤除菌。4保存备用。临用前加入089IV胶原酶，配制成胶原酶液。3灌流缓冲液PERFUSIONBUFFER，PB的配制用电子天平称取NACL279，ZCL1269，NAHC如639，GLUCOSE279，HEPES14349，充分溶解后，加超纯水定容至3000ML，调整PH值至74。022IIM过滤器过滤除菌。4保存备用。4含EDTA的灌流缓冲液PERFUSIONBUFFERWITHEDTA，PBE的配制称取0379EDTA加入1000MLPB中，调整PH值至74。022UM过滤器过滤除菌。4保存备用。5含DISPASE的灌流缓冲液PERFUSIONBUFFERWITHDISPASE，PBD的配制使用前新鲜配制将429DISPASE加入500RALPB中，低温搅拌，调整PH值至75。022ILM过滤器过滤除菌。6含胶原酶的灌流缓冲液PERFUSIONBUFFERWITHCOLLAGENASE，PBC的配制使用前新鲜配制将COLLAGENASE0259、CACLZ2H2002759加入500RALPB，低温搅拌，调整PH值至75。022IIM过滤器过滤除菌，4保存。7肝细胞洗涤缓冲液WASHINGBUFFER，WB的配制用电子天平称取NACI1759，KCL1159，CACL22H200325G，HEPES595G，BSA25G，充分溶解后，加超纯水定容至2500ML，调整PH值至74。O22ILM过滤器过滤除菌。4保存备用。一8含DNASEI的肝细胞洗涤缓冲液WASHINGBUFFERWITHDNASEI，髓DNASEI的配制用电子天平称取MGCIZ6H200159，MGSO7H200159，DNASE0159，充分溶解后，加超纯水定容至1500ML，调整PH值至74。022斗M过滤一器过滤除菌。4保存备用。9肝细胞培养基的配制用含10FBS的WILLIAMSMEDIUME作为肝细胞培养基102台盼蓝溶液TRYPANBLUE的配制称取29台盼蓝，加少量超纯水研磨粉碎后，再加水至50ML，离心后取上清液，再加入18NACL溶液至LOOML，即成工作液。细胞计数时，将L滴细胞悬液与2滴台盼蓝液混合后，滴入细胞计数板。2MIN后，在显微镜下计数至少200个细胞。未着色的为活细胞，里蓝色的为死细胞。计算活细胞百分比。浙江大擘硕士学位论文同等擘力四步灌流法分离肝细胞的实验研究正文11200TOOLL谷胺酰胺液100的配制谷胺酰胺29229溶解至100IIIL超纯水中，充分搅拌溶解后，022PM过滤器过滤除菌。分装，一20保存。使用时每100IL培养液加LML。12青霉素氯霉素溶液100X的配制青霉素10XL矿IU，氯霉素LG，加09生理盐水至100IILL，022UM过滤器过滤除菌。分装，20保存。使用时每100ML培养液加LML。13025胰蛋白酶溶液的配制胰蛋白酶1300250MG，先用超纯水调成糊状，再补足至100ML。搅拌混匀。022ILM过滤器过滤除菌。分装，20保存。二实验方法1、二步灌流法分离猪肝细胞一实验前打开制冰机制冰，水浴箱调到38将含EDTA的DHANKS液预热至38，将WILLI硼SE液冰浴。5公斤体重的中国小型猪实验前12小时禁食，4小时禁水。氯胺酮40MGKG肌肉注射麻醉，安静后将四肢捆绑在手术台上固定，耳缘静脉推注肝素15UKG。常规消毒皮肤，在严格无菌操作下，开腹，暴露门静脉、上腔静脉并结扎，快速分离肝脏后，将肝脏移至无菌不锈钢盆中，称重后进行离体二步灌流。第一步用尖细滴管插入门静脉，采用自行设计的体外灌流系统，通过蠕动泵，将经38预热、含ERA的DHANKS液1000ML，先以180MLMIN灌注5MIN，接着以120M1MIN继续灌注5MIN，彻底去除肝组织内残留血细胞第二步将预热至38，含008型胶原酶的HANKS液400IIIL灌流以80MLMIN的速度灌流，胶原酶液循环重复使用，直至肝包膜与实质分离，整肝疏松，表面里龟背状，停止胶原酶液灌流，用4预冷的WILLIESE150LLLL以150MLMIN灌注终止消化。将肝脏轻轻转移至另一无菌不锈钢盆，摘除胆囊，锐性撕裂肝包膜，去除纤维结缔组织，收集肝细胞。在冰浴条件下分别用80目，150目不锈钢筛网过滤，用WILLIESE制成肝细胞悬液，4、1209、3MIN离心三次，收集肝细胞。浙江大学硕士擘住论文同等学力四步灌流法分离肝细胞的实验研究正文2、四步灌流法分离猪肝细胞实验前打开制冰机制冰，两只水浴箱分别调到38和39“C。将PBE液、PBC液、PB液、PBD液预热至39。将PB液冰浴。5公斤体重中国小型猪按上述方法无菌条件下取肝。分离肝脏后移至无菌不锈钢盆中，称重后，轻轻挤压肝脏，用500ML4“C预冷的PB液冲去肝脏外部血液和血管中残留的血液。采用自行设计豹体外灌流系统，第一步用尖细滴管插入门静脉经蠕动泵连续灌注常温PBE液300ML、预热39“C的PBE液700ML。第二步灌注预热至39的PB液500ML；弃去上述灌流液，将肝脏移至新的无菌不锈钢盆中。第三步灌注预热至39的PBD液500ML。第四步，弃去其中200MLPBD灌流液，继续用预热39“C的PBC液500ML灌流。剩余PBD液300ML与PBC液500ML重复循环灌注，直至肝包膜与实质分离，整肝疏松，表面呈龟背状。摘除胆囊，锐性撕裂肝包膜，去除纤维结缔组织，收集肝细胞悬液。在冰浴条件下用80目不锈钢网筛过滤肝细胞，收集肝细胞悬液，分装至四个250ML的离心瓶中，4“C、509120秒离心；弃上清留40ML左右后轻轻摇匀细胞，每瓶用含DNASE的WBD150ML重悬细胞，再用150目不锈钢网筛尼龙网过滤，肝细胞悬液再次经4。C、509X75秒离心，重复1次；弃上清，用WB重恳细胞、4“C、509X60秒离心，弃上清，沉淀细胞置冰浴中备用。3、肝细胞计数、活率测定对两种方法分离到的肝细胞进行细胞活率和得率的测定在普通显微镜下，用台盼蓝拒染法测定新鲜分离肝细胞的活率。用血细胞计数板计数，计算分离肝细胞的得率4、肝细胞贴壁率测定将新鲜分离肝细胞以5X105ML接种于含10,FBS的WILLIAMSIEDIUME培养基中，培养24H后观察肝细胞生长和贴壁情况13塑兰叁堂塑芏位论文同等擘力四步灌漉法分离肝细胞的实验研究正支5、肝细胞形态学观察用倒置相差显微镜和透射电镜观察新鲜分离、以及培养24H后的肝细胞形态和结构。透射电镜观察时，培养24H的肝细胞，先用胰蛋白酶消化，然后转入锥底离心管中159离心5MIN，使之形成既不松散又不紧密的细胞团块。轻轻移动细胞团块至干净、干燥的青霉素小瓶中，用力适宜，切勿挟碎。新鲜分离的肝细胞，直接转入离心管中，同上操作。肝细胞用25戊二醛、锇酸固定、乙醇脱水，EPON618包埋，超薄切片，柠檬酸铅染色，HITACHIH600A透射电镜观察。6、肝细胞生长曲线测定将肝细胞以5105MT浓度接种至6孔培养板中，每个浓度接种2孔，用含10FBS的WILLIAMSMEDIUME为培养基，连续7天测定肝细胞活率，绘制曲线。三、统计学处理结果用；J表示，用SPSS分析软件进行T检验。14浙江走学硕士学位论文同等学力四步灌流法分离肝细胞的实验研究正丈一、四步灌流法实验流程图中国小型猪第一步灌流后的肝脏消化后的肝脏结果刚取出的肝脏消化中的肝脏收获的肝细胞浙江大学硕士学位论文同等学力四步灌流法分岛肝细胞的实验研充正丈二、肝细胞的活率、得率和贴壁率采用自行设计的体外灌流系统，对中国小型猪肝脏进行常规的胶原酶两步灌流和我们创建的四步灌流法分离肝细胞。结果两种方法分离得到肝细胞的活率、得率和24H贴壁率有显著差异。二步法分离肝细胞的活率是885，后者为954，两者相比有显著性差异P以晒步法分离得到的肝细胞总数是3107X107克肝组织，四步灌流法所得的分离细胞总数为5311107克肝组织，两者相比有显著性差异P以05。二步灌流法分离的肝细胞贴壁率为80，四步灌流法获得的肝细胞贴壁率达90以上，二者相比也有显著性差异PM。且细胞碎片和其它非实质细胞污染极少。结果见表1。袭1分离肝细胞的活率、得率和培养24J，、时后细胞的贴壁情况三、肝细胞形态相差显微镜下观察新鲜分离的肝细胞，细胞透亮、星球形且边界清晰，多数呈单个均匀散在分布见图1；而破损的肝细胞表现为细胞肿胀、出现空泡，胞膜有缺损。培养24H后肝细胞已均匀贴壁，形态扁平、呈多边形、有时可见呈肝板状结构排列见图2在透射电子显微镜下，新鲜分离的单个肝细胞失去了其典型的多边形结构，而呈球形但具有正常肝细胞的超微结构特征，表现为肝细胞膜及核膜完整，各种细胞器清晰可见，胞质均匀一致，线粒体丰富，可见糖原颗粒。在细胞膜水平，典型的毛细胆管和窦间隙极性变得无法辨认，所有的连结复合体一紧密连结、中间连结、缝隙连结和桥粒均消失，短小的丝状突起物均匀地分散在细胞膜表面见图3培养24H后分散的肝细胞重新聚集成团，重新建立细胞连结和极性见图4。16浙江大擘项士学位论文同等擘力四步灌流法分离肝细胞的实验研究正文图L相差显微镜下新鲜分离的肝细胞，箭头所示为死细胞200图2相差显微镜下培养24H后贴壁的肝细胞400图3透射电镜下新鲜分离的单个猪肝细胞形态，细胞呈圆形、胞膜完整、核大N、胞浆内含有大量的线粒体M和肝细胞特有的糖原颗粒以及少量脂肪滴420017浙江走学硕士学位论文同等学力四步灌流法分离肝细胞的实验研究正文图4透射电镜观察培养24H的肝细胞X4200，N为细胞核，M为线粒体四、肝细胞生长曲线新鲜分离的猪肝细胞培养7天，采用细胞记数法观察细胞的生长情况。细胞生长曲线见图5。600000500000逗400000鍪300000藿200000100000OL2345678培养天数图5肝细胞生长曲线18浙江大擘硕士学位论文同等学力四步灌流法分离肝细胞的实验研究正文讨论制备大量、高活性的肝细胞是生物人工肝系统和细胞移植等研究的关键技术之一。目前实验室多用二步胶原酶灌流法，该法能较好地分离鼠或活检组织肝细胞，而猪肝较鼠肝含有更多的胶原及纤维组织，用二步灌流法分离效果不甚理想。本研究在二步灌流法的基础上，添加了HEPES、DISPASE和DNASE等灌流液，利用自制的体外循环装置，建立了四步灌流法，分离的肝细胞得率高最高达64X107克肝组织、活性好最高达99，培养24小时后细胞贴壁率高90；均明显高于常规二步灌流法。用四步灌流法分离人肝细胞，取得同样好的分离效果结果未显示四步灌流法之所以分离效果好于二步分离法，我们认为以下几点是其中的关键1整肝取出后放入无菌不锈钢盆中，首先轻轻挤压肝脏，用含HEPES的平衡盐缓冲液冲洗掉肝脏表面和大血管中残留的血液，对于下一步的EDTA灌流液去除肝脏中血细胞有明显的促进作用，为提高分离效果和分离纯度奠定基础；2用EDTA灌流，可去除钙离子，使细胞间的粘合连接分离，显著减少血细胞凝块，有利于去除器官内的血细胞，使灌洗更充分、更彻底。二步灌流法在未去除肝脏表面和大血管中残留血液的情况下，直接用EDTA冲洗和消化，分离不如四步法充分；3EDTA可螯合钙离子，而胶原酶具有钙离子依赖性，二步灌流法在EDTA灌流后，直接用胶原酶灌流，降低了胶原酶的消化效果；而四步灌流法在胶原酶灌流之前先用含DISPASE的灌流液灌流，加上DISPASE本身对胶原酶的酶解还起协同作用，提高了胶原酶的作用效果；4胶原酶用以消化肝脏基质成分，如层粘连蛋白，纤维连接蛋白，肝硫酸粘蛋白等，进而将紧密连接及间隙连接破坏。胶原酶灌注温度至关重要。胶原酶作用最佳温度是37，四步灌流法中胶原酶液先预热39，可确保循环中的酶液保持37胶原酶的浓度也很重要。浓度与动物的种类、体重有关。本研究发现，中国小型猪510公斤体重和人肝脏，用005IV型胶原酶液，分离效果较好。5在肝细胞洗涤过程中采用含DNASE的洗涤缓冲液具有进一步分离那些19浙江太擘硕士学位论文同等擘力四步灌流法分离肝细胞的实验研究正支成团的和未彻底消化的肝细胞，对于提高肝细胞的活率和得率都具有十分重要的意义；6离心速度和时间也很关键，离心力过低，细胞碎片和非实质细胞去除不彻底，反之会损伤肝细胞。四步法采用低速509、短时60120秒离心，既可避免非实质细胞污染率又可避免因反复离心所致的肝细胞活率下降。通过相差显微镜和透射电镜观察，低速和短时留心，使细胞结构和形态均得到最大限度的保护，细胞活率也大大提高；24H培养后肝细胞贴壁率高达90，且形态良好，肝细胞呈均匀贴壁、多边形板状排列；十分接近肝细胞体内的生长方式。研究结果表明，利用四步灌流法分离猪肝细胞较常规的二步灌流法可获得更高的细胞活率和得率，对于培养后的细胞贴壁也有明显促进作用。7充分洗涤可去除残留的胶原酶和细胞碎片，减少胶原酶对肝细胞的影响，尤其应用培养液洗涤，可提高肝细胞的存活率。结论四步灌流法分离肝细胞，可获得更高的细胞活率和得率，对于培养后的细胞贴壁也有明显促进作用，且细胞碎片和其它非实质细胞污染极少。该法可广泛应用于生物人工肝用肝细胞的分离和其他大规模分离肝细胞的研究。为生物人工肝、细胞移植和药物筛选等研究提供高质量的肝细胞。参考文献1SEGLCNPOPREPARATIONOFISOLATEDRATLIVERCELLSMETHODCELLBI011976，1329832李兰娟人工肝脏杭州浙江大学出版社，20013TANAKAKSOTOGUTIERREZNAVARROALVAREZN，CTA1FUNCTIONFLHEPATOCYTECULTUREANDITSAPPLICATIONTOCELLTHERAPIESCELLTRANSPLANT2006ELSONLJ，NEWSOMEPN，HOWIEAF,ETA1ANIMPROVED麟VIVOMETHODOFPRIMARYPORCINEHEPATOCYTEISOLATIONFORUSEINBIOARTIFICIALLIVERSYSTEMSEURJGASTROENTEMLHEPAT012000，1289239305PRELOVSEKPM，BATISTAU，BULOGBISOLATIONANDPRIMARYCULTUREOFNECTUMS20渐江大学硕士学位论文同等擘力四步灌流法分离肝细胞的实验研究正支MACULOSUSAMPHIBIAURODELAHEPATOCYTESINVITROCELLDEVBIOLANIM2006428一外2552626SAMUELDCLINICALTRIALSUSINGCELLX铡【O掣AFISTHEIRPLACEINTHETREATMENTOFFULMINANTHEPATITISPATHOLBIOLPARIS2000，4844074107CRCMAE，WERNECKAM，MARTINSJUNIORA，ETA1COMPARATIVEANALYSISOFPREPARATIONOFHUMANHEPATOCYTESBYTHEETHYLENEDIAMINETETMACETICACIDANDCOLLAGENASETECHNIQUEACTACIRBRAS2007，22153568MARK一心THONLASFK,HEPATICDRUGDELIVERYANDGENETHERAPYHEPATOLOGY1997，254844919KOBAYASHIN，OKITSUTTANAKANCEL