真核细胞DNA提取与酶切鉴定-liuchang.ppt

1、离心,分子 生物学技术,电泳,层析,光学,生化 实验,生物化学实验的主要技术,生化实验内容安排,第一轮,第二轮：考试（6个实验室）,时间、穿着、仪器不能乱动、赔偿制度、整洁、卫生。,实验报告（如实记录）规范操作（辨认标签）、污染物、毒物、废弃物（酸碱烧伤大量自来水冲洗）,实验报告要求：,题目，组号 实验目的 实验原理 实验操作：如实记录 实验结果及结果分析：实事求是 讨论或小结：认真分析，仔细思考,2020/10/31,5,真核细胞基因组DNA的分离提取及酶切电泳,实验目的,1. 掌握人外周血基因组DNA的提取原理、原 则、提取方法和注意事项，熟悉外源基因 的基本制备方法。 2. 学习琼脂糖凝

2、胶电泳分离鉴定DNA的原理 和技术。,基因组DNA提取的操作流程,实验步骤,、取0.3ml抗凝全血，加入到1.5ml Eppendorf 离心管中。,抗凝剂 EDTA-Na2或枸橼酸钠作为抗凝剂 不宜使用肝素,、加入1ml STMT，充分混匀 使其溶血。,STMT （破坏细胞膜) 葡萄糖：葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受机械作 用而降解。 TrisHCl:不含金属离子,与EDTA更能稳定DNA的活性。 Triton X-100:非离子去污剂（表面活性剂），直接破裂 血中红细胞和白细胞膜，释出血红蛋白及 细胞核。 MgCl2: 提供Mg2+，稳定DNA。,、10000g离心2min，弃上清。

3、,注意离心机的使用 配平 上清丢弃到废液缸，尽量空净。,4、用0.4ml生理盐水洗沉淀，10000g 离心2min，弃上清。,注意离心机的使用 配平 上清丢弃到废液缸，尽量空净。,、加450lNE溶液将沉淀重新悬浮。,NE NaCL: 50mmol/L EDTA: 1.二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 2.降低细胞膜的稳定性,、加50l 10%SDS，迅速混匀;再加50l蛋 白酶K，轻轻摇匀后置50水浴1h。,SDS 1. 溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂 2. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来 3. 对RNA、DNA酶有抑制作用 4. 与蛋白质形成R-O-SO3 .R蛋白质复合物，使

4、蛋白质变性 蛋白酶K(或链霉蛋白酶) 广谱蛋白酶，水解蛋白质。能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性。,、加入TE饱合酚500l，轻摇2min，10000g离心 1min，将上层水相移至另一新Eppendorf管内。,酚能有效地使蛋白质变性； 酚不能抑制RNAase的活性； 酚能溶解入10一15的水分。,、加入酚氯仿异戊醇混合液500l，轻摇 1min，10000g离心1min，将上层水相移至另 一Eppendorf管内。,氯仿也是一种蛋白变性剂，但氯仿的变性作用不如酚。 氯仿有助于加速有机相和水相的分离； 使用两种不同的有机溶剂去除蛋白质比用单一一种有机溶剂效果好。酚和氯仿两者交替反复抽

5、提，还可克服酚的缺点。,、加入氯仿异戊醇混合液500l，轻摇 1min，10000g离心1min，将上层水相移至另 一新Eppendorf管内。（定体积）,移上清时要定量，宁少勿多 氯仿： 将残留在水相中的酚带走 也可以再次使蛋白变性 异戊醇： 降低分子表面张力，减少气泡产生 有助于分层 上层为水相 中间为变性的蛋白 下层为有机相,10、向上清中加入1/10体积的NaAc ，并混匀。 再加入2倍体积的冰冻无水乙醇，充分混匀， 于80放置10min。,核酸是多聚阴离子的水溶性化合物，能与钠、钾、镁等很多1价、2价阳离子形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会被变性。 最常用的沉淀剂为1价

6、钠、钾、铵和锂等离子盐类，如醋酸钠、氯化钠等。 常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇等。,11、10,000g离心5min，弃上清, 将小 管倒置于滤纸上。室温干燥5min。,12、加入20l双蒸水溶解基因组DNA 。,基因组DNA 8l 10 X 缓冲液 1l EcoR 1l,离心甩一下，37温浴1h。 另外剩余的10l留做电泳分析用。,酶切 体系,酶切注意事项,按顺序加样，每加一个样品更换一次tip头 一定要将酶加进去 加酶的时候一定保证低温，在冰上操作 加完后要充分混匀，用离心机“甩”一下再水浴（配平后，随意调时间，将转速调到接近最大值，即刻再调回零）,13、1琼脂糖凝胶电泳检测,1

7、0L 酶切后基因组DNA 2L 10Loading buffer 12L基因组DNA 2L 10Loading buffer 1TBE 恒压100V 电泳 0.5-1h,实验原理,核酸：包括DNA、RNA两种分子。 DNA RNA多呈单链线性分子,双链线性分子,双链环状分子,真核生物DNA,95%存在于细胞核,5%存在于细胞器,真核生物RNA,10%存在于细胞核,15%存在于细胞器,75%存在于细胞质,分离纯化核酸总的原则,应保证核酸一级结构的完整性 排除其它分子的污染,完整性的保证,尽量简化操作步骤，缩短提取过程 减少化学因素对核酸的降解 减少物理因素对核酸的降解 如机械剪切力、高温 防止核

8、酸的生物降解 DNA酶、RNA酶,纯度的保证,核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子 其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度 排除其它核酸分子的污染,从全血中制备基因组DNA,首先用去污剂TritonX-100直接破裂红细胞和白细胞膜，使之释放出血红蛋白及细胞核，通过离心分离即可获得白细胞核； 用SDS破坏核膜；用EDTA抑制DNase的活性；蛋白酶K将蛋白质降解成小肽或氨基酸，从而使DNA释放入水相中。 用酚氯仿抽提除去蛋白质，再用氯仿除去DNA溶液中残存的蛋白质及酚； 用无水乙醇沉淀水相中的DNA，即可获得基因组DNA。 Concise pro

9、cess：破裂细胞消化蛋白质有机抽提除去蛋白质沉淀水相中的DNA。,DNA抽提示意图,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,+,Bam H,Molecular scissor,均来自微生物，并据此而进行命名； 识别序列长度常为4 8 核苷酸序列 ; 大部分酶识别序列呈二元旋转对称结构 即回文结构 ; 其切割后的DNA可产生不同的末端。,限制酶的特点（类酶）,DNA的琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖是从海洋植物琼脂中提取来的，为一种聚合链线性分子。 线性DNA分子在电场中的迁移率与其分子量的对数成反比 DNA的空间构型不同，即使分子量

10、相同其迁移率也不相同,Making an Agarose Gel,Casting tray,Gel combs,Power supply,Gel tank,Cover,Electrical leads ,Electrophoresis Equipment,Gel casting tray & combs,The tray is the actual mold which provides a shape for the gel as it polymerizes. The comb can make some “wells” in the gel.,Seal the edges of the

11、casting tray and put in the combs. Place the casting tray on a level surface. None of the gel combs should be touching the surface of the casting tray.,Preparing the Casting Tray,Agarose,Agarose is a linear polymer extracted from seaweed.,D-galactose,3,6-anhydro L-galactose,Agarose,Buffer Solution,C

12、ombine the agarose powder and buffer solution. Use a flask that is several times larger than the volume of buffer.,Agarose is insoluble at room temperature (left). The agarose solution is boiled until clear (right).,Microwave for about 1 minute to dissolve the agarose.,Melting the Agarose,Allow the

13、agarose solution to cool slightly (60C) and then carefully pour the melted agarose solution into the casting tray. Push any bubbles away to the side using a disposable tip.,Pouring the gel,Each of the gel combs should be submerged in the melted agarose solution.,When cooled, the agarose polymerizes,

14、 forming a flexible gel. It should appear lighter in color when completely cooled (30-45 minutes). Carefully remove the combs and tape.,Place the gel in the electrophoresis chamber.,buffer ,Add enough electrophoresis buffer to cover the gel to a depth of at least 1 mm. Make sure each well is filled

15、with buffer.,Cathode (negative),Anode (positive), wells,DNA,Loading Buffer: Bromophenol Blue (for color) Glycerol (for weight),Sample Preparation,Mix the samples of DNA with the loading buffer (w/ tracking dye). This allows the samples to be seen when loading onto the gel, and increases the density

16、of the samples, causing them to sink into the gel wells.,Loading the Gel,Carefully place the pipette tip over a well and gently expel the sample. The sample should sink into the well. Be careful not to puncture the gel with the pipette tip.,Place the cover on the electrophoresis chamber, connecting

17、the electrical leads to the power supply. Be sure the leads are attached correctly - DNA migrates toward the anode (red).,Running the Gel, wells, Bromophenol Blue,Cathode (-),Anode (+),Gel,After the current is applied, make sure the Gel is running in the correct direction. Bromophenol blue will run

18、in the same direction as the DNA.,DNA (-) ,Staining the Gel,*CAUTION! Ethidium bromide is a powerful mutagen and is moderately toxic. Gloves should be worn at all times., Ethidium bromide(EB) is the special dye of DNA molecules. It binds to DNA and fluoresces under UV light, allowing the visualization of DNA on a Gel. Ethidium bromide can be added