在酵母菌酰胺型生物溶剂中的培养特性研究演示课件

1、酵母菌在酰胺型生物溶剂中的培养特性研究,答 辩 人：高忠添 班 级：生物0711 学 号：2007221026 指导老师：欧光南博士,1,目录,研究背景 研究内容与意义 生物溶剂的设计 微生物培养 实验结果 分析 结论,2,一、研究背景,生物工程学家对微生物和酶在有机溶剂诸多方面展开研究，发现许多具有商业应用价值的化合物能通过酶或微生物转化得到，但是大多数化合物的水溶性差，影响了在水相中的转化效率。而在有机介质中的生物催化已发展成为解决此类问题的一个有效手段。 1984 年以来, 美国麻省理工学院Zaks 和Klibanov 教授为首的研究小组,一直从事非水系统的酶反应研究, 取得了引人注目的

2、成果, 并由此产生了一个全新的分支学科! 非水酶学。多年的研究表明, 用有机溶剂代替水溶剂作为有些酶的反应介质是可行的,3,二、研究内容与意义,本论文通过酿酒酵母菌在含新型有机溶剂N-羟甲基甲酰胺（HOF）的培养基中培养特性的研究，希望开发新型生物溶(Biosolvent)，进一步推动非水相催化工艺的广泛应用和深入发展，为微生物非水培养和药物非水制剂开发奠定理论基础，具有重要的科学和现实意义,4,三、生物溶剂的设计,1、生物溶剂设计基本原则 A生物溶剂母体结构应具有强解离能力，即有高介电常数，以保证电解质电离后能形成自由离子，而不产生离子对。 B电解质的电离决定于溶剂的电离能力，要求溶剂既有较

3、大的AN值（Lewis酸），又有较大的DN值（Lewis碱），即为两性溶剂。 根据上述设计原则，在甲酰胺溶液( = 111.0)母体结构上引入羟基（有大的AN和DN）形成HOF(90.0,5,三、生物溶剂的设计,2、HOF合成 合成路线,甲酰胺20 mL ，碱催化剂NaOH 0.12 g、水25 mL，搅拌溶解，冰浴，缓慢滴加37 %甲醛溶液44 mL ，pH=9，反应24h,6,三、生物溶剂的设计,4、HOF的表征 核磁共振确定HOF是较纯物质,3、HOF纯化 旋转蒸发除去非反应的甲醛和水等物质 离子交换去除离子 旋转蒸发去除水分,7,三、生物溶剂的设计,HOF的油水分配系数测定 三氯乙酸电

4、离常数测定 介电常数测定,5、HOF物化性质的测定,8,四、微生物培养,酿酒酵母菌菌种活化 抑菌实验 HOF对酿酒酵母最低的抑菌浓度 制作生长曲线 酿酒酵母核酸释放量的测定,9,五、结果,1.HOF表征,图1 HOF的 HNMR谱图,10,五、结果,图2 HOF溶液的CNMR,1.HOF表征,由图和图2可知，HOF是较纯物质,11,五、结果,表1 HOF溶液物化参数,1、HOF log P=-1.2说明HOF溶液是一种亲水型有机溶剂； 2、HOF的介电常数为98，与水的介电常数81.0相近，说明HOF的解离能力与水相近； 3、TCA在HOF中的pKa为0.85，在水中则是0.7，说明HOF溶液

5、与水的电离能力相近。 结论：HOF的性质与水相似，是一种潜在的生物溶剂,2、HOF物化性质,12,五、结果,3、酿酒酵母菌种活化,右图3 可知，活化后的菌种是纯正的酵母菌,13,五、结果,4、抑菌实验,a,b,图4 A,I-蒸馏水 C-甲酰胺 B, G,H-生理盐水 D-异丙醇 E,F-HOF 图4 甲酰胺、异丙醇和HOF对酿酒酵母菌均出现抑菌圈，蒸馏水和 生理盐水没有抑菌圈,14,五、结果,表2 酿酒酵母菌在不同HOF浓度下测出的A600值,5、HOF对酿酒酵母菌的最低抑菌浓度,15,五、结果,5、HOF对酿酒酵母菌的最低抑菌浓度,图5：酵母菌在不同浓度 HOF生长情况,由表2可知HOF对酿

6、酒酵母菌的最低抑菌浓度，在0.8%-1%之间,16,五、结果,4、制作生长曲线,图6 酵母菌在30摄氏度的生长曲线,从图6可知酵母菌生长延滞期的时间为3h，对数期的时间为11h，酵母菌对数后期为14h,17,五、结果,5、酿酒酵母菌核酸释放量的测定,表3 酵母菌在不同液体里面，不同时间的A260值,18,五、结果,6、酿酒酵母菌核酸释放量的测定,表3和图7可知： 1、说明核酸有在增殖 2、异丙醇能使核酸变性 3、HOF会影响酵母菌细胞膜和细胞壁，使核酸释放变大，抑制酿酒酵母菌生长,图7 不同溶剂酵母菌溶液,19,六、分析讨论,1、HOF溶液的似水性 log P=-1.2说明HOF溶液是一种亲水

7、型有机溶剂 HOF溶液的介电常数为98，与水的介电常数81.0相近，说明HOF溶液与水的解离能力相近 TCA在HOF中的pKa为0.85，在水中则是0.7，说明HOF溶液与水的电离能力相近。 综上，HOF的物化性质与水非常相似，具有强电离和解离能力，有利于生物催化剂的活性，是一种很有开发潜质的新型生物溶剂,20,六、分析讨论,破壁的酿酒酵母菌核酸释放量随时间的延长而变大，因此，酿酒酵母菌核酸有不同量的增殖。 在异丙醇中破壁核酸量明显比其他三者低，说明异丙醇能使核酸变性。 在HOF中，24 h的核酸释放量明显比其他三者大，可以推测HOF对酿酒酵母细胞壁和细胞膜作用，使酿酒酵母菌核酸大量外泄而抑制

8、其生长。24h破壁的核酸释放量和生理盐水，相差不多，说明HOF不会让核酸变性,2、酿酒酵母菌核酸释放量的测定,21,七、结论,HOF是一种亲水型有机溶剂。 HOF具有强电离和解离能力，是一种很有开发潜质的新型生物溶剂。 HOF具有抑菌作用。 酵母菌在30下，生长对数期后期为14h。 HOF对酿酒酵母菌最低的抑制浓度为0.8%-1% HOF影响细胞膜和细胞壁，使酿酒酵母菌核酸大量外泄而抑制其生长,22,致谢,本论文是在导师欧光南老师的精心指导下完成的。导师无论在工作中还是在生活上都给予了无微不至的关怀，在论文的书写方面，他总会以“专业标准”严格要求我，始终认真负责地给予指导，帮助我开拓思路，提高研究分析能力。正是欧老师的无私帮助与热忱鼓励，我的毕业论文才能够得以顺利完成。在此我表示最诚挚的感谢！ 同时我还要感谢毕业论文实验小组的张玲娇、雷建辉、李雪晶等同学的帮助在