第一章第五节生物药剂学概述

1、第五节 生物药剂学研究方法及其进展一、生物药剂学研究方法生物药剂学经过了四十余年的发展，已经成为一门较为系统、完善的药学学科，并逐渐渗透到了药物研究开发、质量评价及临床应用等各个环节。生物药剂学通过研究不同的药物、相同药物的不同剂型在不同个体的体内过程特征与药物效应之间的关系，揭示药物作用规律。常用的研究方法如下：（一）建立药物质量评价方法随着生物药剂学的发展，药品的质量不再局限于药物的化学结构、主药的含量或杂质的限量等基本内容，而应深入考虑到影响药物体内过程的有关性质上，这不仅使药品质量概念有了深化，也由此提出了更加合理的药品质量控制指标与方法。因此，从生物药剂学角度出发，建立相应的药物质量

2、评价方法，能够更好的保证临床用药的安全性和有效性。1口服固体制剂溶出度与释放度测定方法研究口服固体制剂溶出度与释放度反映了在规定介质中，药物从固体制剂中溶出（或释放）的速度与程度，是评价口服固体制剂质量的重要指标之一。由于难溶性药物的溶出过程是其吸收过程的限速因素，因此溶出度是口服固体制剂质量控制中不可缺少的指标之一，对于研究开发早期的处方筛选、工艺优化中也有着重要意义。口服缓释与控释制剂可较持久地传递药物，减少给药频率，降低血药浓度峰谷现象，并在用药过程中较长时间维持适宜的血药浓度水平，就是通过控制药物从制剂中释放的速度而实现的。因此在口服缓释与控释制剂的研究中，释放度是起决定性作用的质量评

3、价指标。溶出度与释放度测定方法的研究内容，通常包括溶出度测定装置的改进；溶出介质等试验条件的控制；影响溶出度与释放度测定结果的因素考察；体外溶出度、释放度与体内吸收过程相关性考察等。2微粒靶向制剂的粒径及其分布根据机体不同组织或器官的生理学特性不同，具有不同性质与粒径的微粒在体内的滞留性或通透性也不同，可使药物选择性地聚集于不同部位发挥疗效。因此，微粒的粒径大小直接影响靶向制剂的体内分布，是微粒靶向给药系统质量评价的一个非常重要的指标。测定微粒粒径的大小及分布的方法有多种，如光学显微镜法、电子显微镜法、激光衍射法、库尔特计数法、Stokes 沉降法、吸附法等。其中电子显微镜法是应用传统的图像分

4、析方法先拍摄电镜照片，然后逐一测量粒子的尺寸再做统计。而激光衍射法所使用的仪器是激光粒度分析仪，它具有扫描速度快、测定粒子多、代表性强、给出信息量多等优点，与人工测定电镜照片进而计算微粒粒径大小及其分布相比，激光粒度分析仪能更全面、准确地反映出所测微粒的粒径大小。3手性药物的限量控制常用的合成药物中有40%以上为手性药物，然而药物对映体中往往只有一种对映体有显著药理活性，而另一对映体没有活性或活性很弱，加上在体内的立体选择性结合，导致其体内过程的差异。因此，手性药物的立体化学特征以及体内酶、受体等生物大分子的立体特异性是影响手性药物疗效的重要因素之一。手性药物的质量标准应能充分体现其立体化学特

5、征。选用具有立体选择性的方法对手性药物进行定性鉴别、定量纯度检查，以及定量检测异构体杂质的含量是手性药物质量控制的重要手段之一。随着现代分析技术的不断发展和完善，对手性药物的研究也越来越重视。手性药物的分析方法有很多，如比旋度测定法、手性色谱法（手性HPLC及毛细管电泳等）、手性衍生法等。（二）建立新型给药途径的实验方法传统给药途径与剂型已经不能满足现代医疗需要，黏膜给药及经皮给药等新型给药途径正在迅速发展。开发新的给药方法，需要对药物的体内过程，特别是药物的转运机制及影响药物体内过程的因素，进行准确、详细的研究。在研究的过程中必需选择合适的实验装置与材料，建立正确的研究方法。如经皮给药研究中

6、，需建立体外药物经皮扩散实验方法，用于了解药物在皮肤内透过的过程、研究影响经皮透过的因素和筛选经皮给药系统的处方组成等。鼻腔给药需研究鼻黏膜中酶对药物的降解作用及药物或辅料对鼻黏膜纤毛运动的毒性作用。（三）建立模拟体内过程的研究方法1药物吸收试验方法药物经给药部位吸收进入体循环的速度与程度是口服药物发挥治疗作用的关键。药物吸收试验主要研究药物在胃肠道的吸收动力学、有效吸收部位、吸收机制、影响吸收的因素等，对剂型的设计、制备工艺的改进、临床给药方案的制定都具有重要的指导意义。常用的评价药物吸收的研究方法有体外法、在体法和体内法三种3。体外研究方法通常采用离体实验模型，有组织流动室法、外翻肠囊法、

7、外翻环法及细胞培养模型。其中，Caco-2细胞模型法广泛应用于研究药物的吸收机制，预测各种途径药物的转运，目前已成为药物吸收研究的一种快速筛选工具。在体研究方法通常采用原位实验模型，主要有肠道灌流法、肠道血管灌流技术、肠肝血管灌流技术等。体内法通常是在口服给予药物后，测定体内药量求算药物动力学参数，来评价药物的吸收速度和程度。2血浆蛋白结合试验方法进入血液中的药物，一部分与血浆蛋白成为结合型药物，另一部分在血液中呈非结合型的游离状态存在。通常只有游离型药物才能透过毛细血管向各组织器官分布，因此药物的血浆蛋白结合是影响体内分布的重要因素。血浆蛋白结合试验主要研究药物与血浆蛋白结合的机制、潜在的结

8、合相互作用、血浆蛋白结合对膜转运的影响等内容。在新药的血浆蛋白结合研究中，主要是测定血浆蛋白结合率。研究药物与血浆蛋白结合的方法主要有平衡透析法、超滤法、超速离心法、凝胶过滤法等4,5。根据药物的理化性质及实验室条件，应选用一种方法至少进行3个药物浓度（包括有效浓度在内）的血浆蛋白结合率试验，每个浓度至少应重复试验3次，以了解药物的血浆蛋白结合率是否具有浓度依赖性。3药物代谢试验方法 药物进入机体后，在体内酶和体液环境作用下，可发生一系列化学反应，导致药物化学结构上的转变，这就是药物代谢过程。药物代谢不仅影响药物作用的强弱和持续时间的长短，而且还会影响药物治疗的安全性，具有重要的现实意义。药物

9、代谢试验主要研究药物代谢途径、代谢速率、代谢过程的影响因素及其影响规律，代谢与药物活性和安全性的关系等。通过对药物代谢的研究，掌握药物代谢规律，对于设计更合理的给药途径、给药方法、给药剂量以及对制剂处方的设计、工艺改革和临床给药方案的制定都具有指导意义6。目前药物代谢研究的方法主要有体内和体外两种方法7。药物代谢的体外试验方法有离体肝脏灌流法、肝组织切片法、肝微粒体温孵法、肝细胞体外培养法等。其中，离体肝脏灌流法使肝脏具有独立并接近于生理条件的循环体系，具有器官水平的优势，兼具离体试验与整体试验的优点，是经典的研究药物代谢的方法；肝组织切片法不破坏肝脏的细胞构成和组织结构，完整保留了所有肝药酶

10、及各种细胞器的活性，因而更能反映药物在体内生理条件下的实际代谢情况。体外代谢法可以比较方便地控制某些代谢条件，在短时间内可得到大量的代谢产物，易于尽快确定药物代谢途径及结构变化情况，但是其不能全面反映体内的综合代谢情况，与生物体内的真实代谢情况存在一定差异。而体内代谢法可以综合地考虑各种体内因素对药物的影响，能够真实全面地反映药物代谢的体内整体特征。体内代谢法是指在动物或人服药之后，测定药物及其代谢产物在血液、尿液和胆汁等生物样品中的浓度，计算有关代谢速度参数，分离鉴定可能的代谢产物，解析药物代谢途径。目前常用的体内代谢法有药物探针法和体内指标法。其中药物探针法是借助于探针药物测定其清除率，以

11、反映同工酶的活性，研究与该同工酶有关的其他药物的代谢。而体内指标法利用某些内源性物质及其代谢物的水平变化，反映药物代谢酶或代谢途径的变化。体内代谢法与体外法相比难度比较大，许多药物在生物体内的分布都比较广，使药物及其代谢产物在体内的浓度都比较低，代谢产物的检测具有一定的难度8。但是，随着现代分析技术的不断提高，体内代谢法逐渐被广泛应用。（四）生物利用度及生物等效性研究方法生物利用度是指制剂中药物被吸收进入体循环的速度与程度，它已经成为血管外给药制剂开发研究时必须考虑的重要质量评价指标。生物利用度与溶出度和释放度相比，更能反映药物的体内过程。即使溶出度或释放度相同的药物，其吸收的速度也不一定相同

12、，而生物利用度则考虑了药物透膜吸收过程及其影响因素。此外，生物利用度的研究方法主要有血药浓度法、尿药浓度法及药理效应法，其测定结果与药物效应的关系更加密切。对生物利用度的研究，主要有实验设计方法、实验方法、实验结果处理、影响制剂生物利用度的因素考察等。生物等效性是指一种药物的不同制剂在相同的试验条件下，给予相同剂量，其吸收程度和速度无明显差异。药学等效性与生物等效性不同，药学等效性是指同一药物相同剂量制成同一制剂，但非活性成分不一定相同，在含量、纯度、含量均匀度、崩解时间、溶出速度方面符合同一规定标准的制剂。药学等效性没有反映药物制剂在体内的情况，这是二者的主要区别。生物等效性指标的提出和应用

13、，为药物应用于临床的有效性和安全性提供了进一步的保证。目前，药物制剂生物等效性已经成为国内外药物仿制或移植品种的重要评价内容，也成为药物制剂开发研究中最有价值的评价指标而被广泛应用。（五）临床药物应用方法研究在药物临床应用中，通过对药物体内过程规律的研究，尤其是对影响药物体内过程的各种因素的研究，可以指导合理给药方案的拟定和对临床用药问题进行合理解释。如通过食物对药物吸收的影响研究和人体生物节律性对药物体内过程的影响研究等，可以确定最佳给药时间；通过不同生理、病理条件下药物体内过程的差异研究，可以制定个体化给药方案；通过联合用药对药物体内过程的影响考察，可以为临床联合用药提供依据等。二、生物药

14、剂学研究的新技术与新方法（一）定量构效关系及定量构动关系研究定量构效关系（Quantitative structure-activity relationship，QSAR）与定量构动关系（Quantitative structure-pharmacokinetics relationship，QSPR），是一种借助分子的理化性质参数或结构参数，通过数学模式来探讨化合物的分子结构及性质与其在人体内的体内过程及药动学参数之间的定量关系9。根据配体与受体间相互作用的原理，计算机辅助药物设计（computer -aided drug design，CADD）运用计算机进行QSAR和QSPR的研究，可

15、以快速地设计和筛选目标化合物，有效地节省因化学合成和体内外实验而耗费的大量时间及资金，提高新药开发效率，缩短开发进程。（二）分子生物学技术与细胞生物学技术分子生物学技术与细胞生物学技术的发展大大促进了生物药剂学的研究进展。建立细胞培养模型使药物吸收的研究取得重要进展，其最早被用于筛选抗微生物药物，随着高通量药物筛选的需要，细胞模型迅速发展成熟起来。在药物设计与开发过程中应用细胞模型可以测定候选药物的透膜性能，研究其转运途径和代谢，以预测其是否具有优良的体内药动学特性，是否具有进一步开发的潜力10。Caco-2细胞模型（the human colon adenocarcinoma cell li

16、nes）是目前最好的体外吸收模型之一，它作为药物吸收研究的快速筛选工具，可在细胞水平上提供药物分子透过小肠黏膜的吸收、分布、代谢、转运以及毒性的综合信息，已成为研究药物吸收机制和药物相互作用等的重要工具。Caco-2细胞系来源于人的结肠腺癌细胞，其结构和生化作用类似于人小肠上皮细胞，含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系，与正常的成熟小肠上皮细胞在体外培育过程中出现逆向分化不同。Caco-2细胞在传统的细胞培养条件下，生长在多孔的可渗透的聚酯膜上可达到融合并自发分化为肠上皮细胞，形成连续的单层。与其它复杂的吸收模型不同的是Caco-2细胞模型没有很多不确定的变化因素，且存在于小肠上皮中的各种转运系统、

17、代谢酶都存在于Caco-2细胞中。因此Caco-2细胞模型可作为研究小肠表皮细胞药物转运和代谢的体外模型。其优点为：省时；可测定药物的细胞摄取及跨膜转运；Caco-2细胞内有药物代谢酶，可在有代谢状况下测定药物的跨膜转运；Caco-2细胞同源性好，生命力强；可用于区分肠腔内不同吸收途径的差别。但Caco-2细胞也有一定的缺点：缺乏小肠上皮的粘液层；缺少细胞异质性（单一细胞构成）；缺少部分代谢酶；此模型不能说明生理参数如小肠流动性或运送时间在药物吸收中的作用；细胞培养的时间和代系对于Caco-2细胞的形态学和生理学性质有影响，从而影响细胞对药物的转运。尽管Caco-2细胞模型有许多限制，但是在阐

18、明药物吸收机制、预测体内吸收和药物相互作用、设计具有更好吸收和更高生物利用度的口服药物制剂、评价制剂的安全性等方面仍然是一个很好的工具。Caco-2细胞模型适用于新药开发的早期阶段，用来研究药物的吸收过程，在一定程度上有较高的重现性。随着新一代细胞模型（如加速的Caco-2细胞穿透模型、TC-7细胞模型）的建立，原有的Caco-2细胞单层模型的一些缺点将得到克服，细胞模型在药物开发研究中将发挥愈来愈大的作用，Caco-2细胞模型的研究与应用则为其它细胞模型的建立奠定了良好的基础。（三）生物物理实验技术近代物理实验技术的发展及其在生物药剂学领域的应用，促使生物药剂学的研究进入到细胞和分子水平。这

19、类实验技术种类繁多，但就其本质来说，大部分都是通过对所研究的生物体系（组织、亚细胞、生物大分子等）施加电磁辐射、电子束、中子束、离子束等物理作用，使外来微粒流与生物体系的原子或分子发生相互作用，探测作用前后微粒能量及其分布的变化以获得所研究生物体系微观结构及其运动状态的方法。如电子显微技术以及近年研制成功的扫描隧道显微技术，可以观察亚细胞结构乃至生物大分子形象，可用来研究大分子药物与靶细胞的相互作用；中子衍射方法用于研究药物分子在磷脂双分子层中的位置；振动光谱用于研究药物与生物膜的相互作用；红外光谱研究药物对脂质体相行为影响及其分子机理；拉曼和红外光谱用于研究脂质体与抗体的相互作用等。（四）微

20、透析技术微透析（microdialysis）技术是从上世纪八十年代发展起来的一种微量生物化学采样、检测技术，它利用渗透和扩散原理，在非平衡条件下，膜外小分子物质通过扩散进入透析管内，并被微透析管中连续流动的灌流液不断带出，从而达到从活体组织取样的目的。由于该技术具有活体取样、动态观察、定量分析、对组织损伤小、取样少、方便、快捷、可连续监测且易实现自动化等优点，因此已被广泛应用于医学、药学、生命科学等领域。微透析技术是一种在体取样技术，其最大优点是可在基本不干扰体内正常生命过程的情况下进行在体（in vivo）、实时（real time）和在线（on line）取样。微透析技术的这些特点使其在生

21、物药剂学研究中的应用倍受关注。应用微透析技术研究药物分布，勿需处死动物和制备组织匀浆，可完整提供每只动物在考察部位的药物浓度-时间资料，改善统计精密度，并可减少实验动物数和个体差异；研究药物代谢，不破坏机体完整性，可维持实际生理条件，消除了传统药物代谢研究中，因组织均匀化破坏细胞隔室造成对代谢研究结果的影响，并可获得有关药物代谢中间过程的信息，而传统方法对血清、尿或粪便中代谢物浓度测定只能了解代谢的最终产物，而不能反映中间过程；采用微透析技术研究药动学勿需采血，即可从同一动物收集大量样本而不损失体液量，避免了传统研究方法中因采血后血容量减少所造成对药物分布及消除的影响，其时间分辨性可使药动学资

22、料更准确。微透析技术最早主要用于研究药物向中枢神经系统分布，最近报道的大量文献反映了微透析探针埋入其它各种不同组织应用的可行性。同时利用多个微透析探针可以在不同器官及同一器官的不同部位取样，研究药物的组织分布和代谢，对于阐明药物体内过程、疗效和安全性有重要意义，为新药研发与临床合理用药提供科学依据。微透析技术除用于动物模型研究外，在人体的研究特别是临床应用方面正以较快速度发展。利用组织微透析直接测定靶组织中药物浓度，为给药个体化提供了一种更有价值的方法，微透析技术对于阐明化疗晚期药物向靶组织和产生毒性组织的释药动力学也是一种极有用的方法。（五）人工神经网络技术人工神经网络(artificial

23、 neural network，ANN ) 是一种通过模拟生物学意义上的人脑神经元及其互联网络的功能，利用神经计算的非线性并行处理等特征，进行联想、分类及非逻辑归纳等信息处理的算法数学模型11。这种网络依靠系统的复杂程度，通过调整内部大量节点之间相互连接的关系，从而达到处理信息的目的。自从二十世纪80年代初兴起的二次神经网络热潮以来，人工神经网络以其独特的模拟、学习、分类能力，在制剂设计、构效关系研究、体内外相关性研究、生物药剂学和药物动力学以及临床药学等方面得到了广泛的应用。1、药物构效关系研究用ANN技术来进行药物构效关系的研究，在模式分类与定量构效关系方面取得了良好的结果。以往定量构效关系的建模方法大多基于统计原理，局限于线性模型，只能进行简单的非线性处理，由此建立的模型较难契合实际构效关系。由于神经网络不是显式的数学模型，而是将构效关系知识隐式分布于网络之中，映射出复杂的非线性关系，因而可以较好地处理具有非线性性质的定量构效关系。我国学者采用改进的ANN方法对喜树碱类抗肿瘤药物的构效关系进