第一节DNA的复制

1、第一节 DNA的复制(DNA Replication) 一、DNA复制的基本特性 1. 半保留性(Semi-Conservative) Meselson-Stahl实验 2. 双向复制(一般) 复制起始点(origin)+两侧复制叉=复制单位(复制子, Replicon) 3.半不连续性(Semi-discontinuous) 前导链(leading strand)-连续合成随从链(Lagging Strand)-不连续,由岗崎片段(okazaki fragment)连接而成. 二、DNA复制必需的成份(真核生物) 1.染色体DNA复制必需三种核苷酸序列复制起点着丝粒端粒. 2 RNA引物(R

2、NA Primer) 一般8-14nt.带游离3 -OH末端. 3.参加DNA复制的主要酶和蛋白质 DNA聚合酶(DNA Polymerase) 真核DNA复制的主要酶DNA Pol a/. 功能:从5 -3 方向延伸与模板互补的子代链. 引发酶(Primase) 与其他多种蛋白组成多蛋白复合体-引发体(Primosome).催化RNA引物合成和复制起始. DNA连接酶(DNA Ligase) 催化一个双链DNA的5 磷酸与另一双链DNA的3 -OH形成磷酸二酯键. DNA解链酶(DNA Helicase),打开DNA双链. 增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear

3、 antigen.PCNA) 辅助催化前导链合成. 端粒酶(Telomerase) 末端复制问题。 端粒酶负责染色体末端(端粒)复制,是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白.其中的RNA成分是端粒复制的模板.(因此端粒是逆转 录酶) 作用:维持端粒长度. 端粒酶活性可用基于PCR的“TRAP”（Telomerase repeat amplification protocol）法测定（Kim,N et al.,science,266,2011-2014(1994) 端粒与细胞寿命。端粒、端粒酶与肿瘤的关系：绝大多数恶性肿瘤具有端粒酶活性但端粒缩短，但也有约5%的肿瘤无端粒酶活性且端粒 较长。端粒酶作

4、为新的肿瘤标志和肿瘤治疗靶点. 第二节 DNA修复（DNA repair） DNA修复是维持基因组完整性的重要机制，在保护基因组避免发生可能导致肿瘤或遗传疾病的突变中起关键的作用。引起DNA损伤的 因素： 1、 细胞内源性损伤因素： DNA复制错误；自发损伤包括碱基互变异构、碱基脱氨（CU、AI）和碱基丢失等；氧化代谢副产物如活性氧物质（React ive oxygen species，ROS）的攻击等。 2、 环境中的损伤因素：辐射（含紫外线、X射线）产生胸腺嘧啶二聚体；化学致癌物（氧化脱氨，烷化剂或代谢活化物如苯并芘、黄曲霉素 等产生碱基加合物）一、碱基切除修复(Base excision

5、 repair、BER) 该途径中最关键的是必须通过一种糖苷酶(glycosylase)先除去变异碱基(如被氧化、烷基化或脱氨的碱基)，该糖苷酶催 化连接损伤碱基与脱氧核糖之间的糖苷键水解，释放游离碱基并在DNA中产生一个去碱基位点，然后由去嘌呤去嘧啶(AP)核酸内 切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶等利用相对的一条正常链为模板进行修补合成。 BER途径中的重要糖苷酶： (1)尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)，从DNA中除去尿嘧啶碱基； (2)3甲基腺嘌吟(3MeA)DNA糖苷酶，可修复烷化剂产生的损伤； (3)负责修复DNA氧化损伤的糖苷酶（如FpgMutM DNA糖苷酶） BER是修复内源性DN

6、A损伤(自发水解、烷基化和活性氧攻击)的主要途径，因此对于降低自发突变的频率、防止肿瘤发生有重要作 用。二、核苷酸切除修复(Nucleotide excision repair，NER) 首先由多聚体复合物识别损伤，再在损伤的两侧进行切除。随着DNA链被解开，包含损伤的单链片段释放出来，留下的缺口由DNA聚 合酶填补，DNA连接酶封闭。该途径包括20种以上蛋白，可以修复紫外辐射诱导的环丁烷嘧啶二聚体(CPD)和(64)光产物 (64)PPs)，以及一些化学物质产生的大加合物。人的NER系统有关基因及其蛋白质产物功能。 NER系统缺陷与着色性干皮病（Xeroderm pigmentosum,XP

7、） NER可再分为二条子途径： (1)全基因组修复(Global Genomic repair，GGR)途径：修复整个基因组内的损伤，其效率取决于损伤的化学特性、损伤部位的DNA序列和染色质结构。 (2)转录藕联修复(Trancsriptioncoupled repair，TCR，)：特异地修复基因组中具有转录活性(即表达)的基因的被转录DNA链上的损伤，该途径的 特点是依赖RNA聚合酶II催化的转录，其中的一些蛋白是普通转录因子TFIIH 的亚基。三、错配修复(Mismatch repair) 负责修复DNA复制过程中由于错误掺入而产生的错配。 STR序列复制-模板链的滑动产生小的环状突出(

8、loop)- 重复序列扩张（expansion）或丢失：微卫星不稳定性（microsatellite instability） E coli中的MMR途径需要mutS,mutH,mutL和uvrD基因产物和特异性核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶等 。在酵母和人类已鉴定了mutS,mutH的多种同源物。遗传性非息肉性结肠癌（HNPCC）基因缺陷。微卫性不稳定与肿瘤。新 的肿瘤基因诊断标志。四、重组修复(Recomhinant repair) 修复DNA的两条链均受损伤的部位的双链断裂或链间交连。 Further readings: 1 Wood RD，DNA repair in eukar

9、yotes，Ann Rev Biochem，1996，65：135167 2 Krokan HE,et a1., DNA glycosylase in the base excision repair of DNABiochem J，1997，325：116 3 Vrieling H，et a1., Transcription coupled repair and its impact on mutagenesis，Mutation Res，1998，400：135142 第三节 重组(recombination) 重组的本质是基因的重排或交换.即2个DNA分子间或一个DNA分子的不同部位间,

10、通过断裂和重接,交换DNA片段从而改变基因 的组合和序列. 一.同源重组(Homologous recombination) 指DNA同源序列间的重组,常发生于两个较长的同源DNA片段或同源染色体之间。 可通过同源重组将外源基因定位整合到细胞基因组中. 二.转座(transposition) 可移动的DNA元件(mobile DNA elements) -转座元件(Transposable element).它是指那些可在DNA分子内或DNA分子间转移的DNA片段. 转座元件的转移过程-转座转座的特点: 1.转座后原来位置的转座元件序列仍然保留,但同时又把新合成的DNA 复本插入到另外一个位点

11、. 2.转座过程需要转座酶(transposase).它催化断裂和重接两步连续的 过程(需要M2+) 3.转座元件插入位置的两茶有3-12bp的正向重复序列(靶序列),它是由于转座酶错位切割DNA造成的.这种短正向重复序列 是存在转座元件的特征. 转座元件的分类 转座子(transposon):通过DNA复制而转移的转座元件. 逆转座子(retroposon)或返座子,通过RNA阶段实现转移的转座元件 (DNA RNA DNA 插入新位点) 逆转座子例:Alu.LINE1.逆假基因(retro-pseudogene) 转座的遗传效应-导致基因重排、插入、缺失。基因组学:是研究基因组的科学，它以

12、分子生物学、电子计算机和信息网络技术为研究手段，以生物体内全部基因为研究对象，在全基因组背景下和整体水平上探索生命活动的内在规律及内外环境对集体影响机制的科学。 RFLP（限制性片段长度多态性）: 限制性内切酶能识别和切割特异核苷酸序列,由于DNA某一位点上的变异有可能引起该位点特异性的酶切位点的改变，当用限制性内切酶处理不同生物个体的DNA时，致使酶切片段长度发生变化，个体间出现限制性片段长度的差异，即为RFLP。SNP（单核苷酸多态性）：同一物种不同个体基因组DNA的等位序列上单个核苷酸存在差异的现象。比较的是DNA相同序列长度里的单个碱基的差别。 药物基因组学：是研究遗传变异与药物反应相

13、互关系的一门学科，是以提高药物的疗效及安全性为目标。 转座子：原核和真核生物基因组中的可以从一个部位转移到另一个部位的DNA序列，这些序列称为转座子(Transposon) 同源重组：指发生在两条DNA的同源序列之间,涉及的是大片段同源DNA序列的交换。只要两条DNA序列相同或相近就可以在序列任一点发生同源重组 位点特异性重组(Site-specific recombination )：指不依赖于DNA序列的同源性,而依赖于能与某些酶相结合的特异DNA序列的重组. 复制子：一个复制子是一个复制单位,包括复制所需的控制元件、起始点和终点。（复制子可以是线状也可以是环状；细菌和病毒一个DNA分子就

14、是一个复制子;真核生物含有多个复制子,两个起始点之间的DNA片段就是一个复制子;） 启动子：指RNA聚合酶识别、结合并起始转录的一段高度保守的DNA序列。 终止子：DNA中能被转录出现在mRNA中终止转录的信号序列。 增强子：增强子是能刺激DNA转录的DNA序列，一般位于-100以上,又称远上序列（far upstream sequence） RNA剪接：转录后把内含子切除而把外显子连接起来产生成熟RNA分子的过程RNA编辑：指转录后的RNA在编码区发生碱基的替换、插入或丢失等现象。 gRNA：独立于核基因的尿嘧啶残基 特异性插入这些残基的信息,指导RNA与被编辑区及其周围部分核酸序列虽然有相

15、当程度的互补性，但该RNA上存在一些未能配对的腺嘌呤，形成缺口，为插入尿嘧啶提供了模板。 遗传密码：将能编码蛋白质氨基酸序列的基因中的核苷酸体系成为。密码子：翻译时核蛋白体是以三个核苷酸为一组“阅读”mRNA的，该三联核苷酸的序列为。起始密码子：被核蛋白体“阅读”的第一个AUG密码子称之为。简并性：除甲硫氨酸和色氨酸外氨基酸都具有一个以上密码子，即。 同义密码子：编码相同氨基酸的密码子称为密码子家族，其成员互称为。 摆动碱基配对：密码子中的第三个碱基总是处在一个不稳定的位置上，它与反密码子的第一个碱基配对结合的强度不如前两个碱基，这类配对称为。单顺反子mRNA：真核生物中剪接后的的每一种mRN

16、A通常只能编码一种蛋白质，这种mRNA属于。 S-D序列：原核生物mRNA的起始密码子AUG上游4-7个核苷酸以外有一段5-UAAGGAGG-3的保守核苷酸序列称为 Kozak序列：真核生物mRNA无S-D序列，核蛋白体小亚基识别5端帽子结构，随后移动到起始密码子处，起始密码子常处于-CCACCAUGG-序列之中，这段保守序列的参在能增加翻译起始的效率，此序列称为。分子伴侣：一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质。 KDEL：ER中蛋白在RER上合成进入ER内腔再转运至高尔基体，但这些PrC端有特殊的识别信号Lys-Asp-Glu-Leu，所以又被送回至ER。 泛素降解系统：泛素是真核细胞

17、中最保守序列之一，酵母和人的泛素无差异，经3步酶促反应共价连接到待降解的蛋白上。 管家基因：理论上在所有细胞中都能进行正常表达，并为所有类型细胞的生命活动提供基本功能的基因，其产物在不同细胞中的浓度大体保持一致，不易受环境调经的影响，有其紧密的调控机制以保持基因的表达水平保持在恒定状态，ep.参加羧酸循环和糖酵解过程。奢侈基因：又叫可调节基因，是在特殊的细胞类型中为特化功能蛋白编码的基因，其表达和调控机制都受到环境条件的影响。 可诱导：指某种信号使得基因表达水平提高，基因产物增多，这种基因叫可诱导基因，这个过程叫诱导。可阻遏：与可诱导相反，某种信号使基因表达水平降低，基因产物减少，这种基因叫可

18、阻遏基因，此过程叫阻遏。结构基因：指编码蛋白或RNA的任何基因，它们编码功能各异的蛋白和RNA，作为酶、细胞骨架结构以及调节蛋白等。 调节基因：是参与其他基因表达调控的基因，编码的产物是RNA或蛋白，调节基因的产物通过与DNA序列上的特定位点结合来控制调节靶基因表达，可使基因的表达上升（正调控）或下降（负调控），调节基因位于受调节基因的上游，也有例外。 操纵子：是原核生物细胞DNA上的一段区域，由若干功能相关的结构基因和控制这些基因表达的元件组成一个完整的连续的基因表达协调单位。结构基因；控制元件；调节基因 调节子：受控于同一调节蛋白的多个操纵子。 效应物：可与调节蛋白协同开启或关闭操纵基因，

19、诱导或阻遏操纵子种结构基因表达的小分子物质，可分为诱导物和辅诱导物。 诱导物：能诱导操纵子中结构基因表达的物质，一般是诱导酶的作用底物或结构类似物。诱导物与激活或阻遏蛋白作用，实现可诱导的正或负调控。 辅诱导物：与阻遏蛋白相互作用，使操纵子去阻遏的某种分子，使结构基因得以表达。 阻遏物：与操纵基因结合，阻碍RNA聚合酶通过操纵基因而关闭操纵子结构基因的转录。 辅阻遏物：与阻遏蛋白结合，一般合成代谢操纵子中的结构基因的产物或类似物。 激活蛋白/无辅基诱导蛋白/激活子：是正控制系统中由调节基因编码的蛋白产物，只有当其处在活化状态时结构基因才能被转录。 阻遏蛋白：负调控系统中调节基因的产物，结构基因

20、的转录可被阻遏蛋白关闭，当其缺乏或失活时结构基因开始转录。 正调控：是一种转录水平的调节机制。调节基因编码的调节蛋白酶是激活蛋白，与效应物分子协同结合在-35序列上游，与DNA和RNA转录酶作用，开启结构基因的转录。 负调控：是一种转录水平的调控机制。调节基因编码的调节蛋白是阻遏蛋白，本身与辅阻遏物一起与操纵子结合，可阻止结构基因的转录，但当有诱导物和阻遏蛋白结合后，阻遏蛋白就会失去活性而不在与操纵子基因结合，使得结构基因转录得以进行。 本底表达：结构基因闭合时，lac操纵子也有表达，但水平较低难以检测，每个细胞中的-半乳糖苷酶不超过5个。 操纵基因O/lacO：不编码任何产物，与阻遏蛋白作用

21、调节下游结构基因的转录。lacZ=-半乳糖糖苷酶；Y=-半乳糖苷透性酶；A=-半乳糖苷乙酰基酶的转录。 IPTG：异丙基-D-硫代半乳糖苷，诱导结构基因表达，但不被-半乳糖苷酶水解，实验室合成的小分子。 因子的级联取代：通过有序的因子替换让RNA聚合酶识别不同基因的启动子，使芽孢形成有关的基因有序地表达。 SOS反应：当细菌染色体受到较多的损伤而复制受阻，或核酸合成时缺乏核苷酸等时会引发细胞的一系列反应/DNA修复能力增强、诱变率提高、细胞裂解停止等，叫，由调节蛋白RecA和LexA共同调节完成，阻遏蛋白LexA除去依赖于RecA。 自体调控：当蛋白质产生过多时，蛋白会与自己的mRNA结合而抑

22、制蛋白的翻译，维持蛋白和rRNA之间的平衡关系。 严谨反应：当细菌的蛋白质合成出现氨基酸短缺或氨酰tRNA合成酶失活会引起，这时细菌为节省贮存物将代谢活动降到最低，关闭大部分代谢活动，tRNA和rRNA合成下降10-20倍，这是细菌根据外界条件调节其生长速度的一种方式。 细菌体内饥饿信号ppGpp、pppGpp，由严谨控制子SF合成，编码SF的基因relA位于核糖体上。 瞬时调控/通过基因迅速的打开或关闭，来对环境条件的改变或细胞和组织的生理条件改变做出应答& 发育调控/能控制真核细胞生长、分化、发育的全进程。 短期可逆调控：对环境的改变、代谢物激素水平变化的反应，变现为细胞内酶蛋白合成水平的变化。 长期调控：受到内在程序化的控制和外界环境的变化关系不大，与细胞决定分化有关，仅见