完整版碱裂解法制备质粒的各种溶液的作用及可能出现的问题

1、 碱裂解法制备质粒的各种溶液的作用 及提取中可能出现的问题 一、质粒提取三种溶液的作用：I 溶液1. pH 8.0，10 mM EDTA，溶液：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HClpH因此用适当浓度的和适当首先要控制好溶液的pH，任何生物化学反应， 50 mM葡萄糖那么是干什么的呢？加值的Tris-HCl溶液，是再自然不过的了。 了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此， 如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言几乎没有任何影响，所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配 在分子生物学试剂中的主要作用是：抑

2、制DNase的活性，和抑制微生物生长。在 溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属 离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要是在不太长的时 间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果手上正好缺了溶液I，可不可以抽质粒呢？只要用等体积的水或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。 1. 溶液II 溶液II，0.2 N NaOH，1% SDS 轮到溶液II了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4

3、N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌(不妨可以自己试一下)，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是

4、由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加 SDS呢?那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长 千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦。 1. 溶液III 溶液III：3 M 醋酸钾，2 M 醋酸 溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果这样怀疑，往1%的SDS溶液中加2M醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现

5、显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS，也会有少量沉淀，但量上要少得多， 显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会 不会是遇盐发生的沉淀呢？在1%的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠(SDS)遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾(PDS)，而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。

6、大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。 那么 2 M 的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和 NaOH ，因为长时间 的碱性条件会打断 DNA，所以要中和之。基因组 DNA 一旦发生断裂， 只要是 50100 kb 大小的片断，就没有办法再被 PDS 共沉淀了。所以碱处 理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因 组

7、DNA 混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总 DNA 条带。很多人误认 为是溶液 III 加入后基因组 DNA 无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好， DNA 分子在中性溶液中都是溶解的。 NaOH 本来是为了溶解细胞而用的， DNA 分子的变性其实是个副产物， 与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液 III 加入并混合均匀后在冰上放置，目 的是为了PDS 沉淀更充分一点。 不要以为 PDS 沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了， 其实还有很多蛋白质不能被沉淀，因此要用酚 /氯仿 /异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒 DNA，不然时间一长就会因为混

8、入的 DNase 而发生降解。这里用 25/24/1 的酚 /氯仿/异戊醇是有很多道理的，这里做个全面的介绍。酚（ Phenol）对蛋白质的变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大 程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液 不利于含质粒的水相 的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上层，4M （比如的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚 /氯仿始终在下层，方便水相的 回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚 溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应） ，因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除， 而用酚 /氯仿的

9、混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净 而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加，其作用主要是为了 让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。 二、质粒提取常见问题解析 1、涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？ 涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。 2、原先测序鉴定没有问题的细菌， 37摇菌后发现质粒大小或序列出现异常? 这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中

10、。解决办法： （1） 降低培养温度，在 2025下培养，或室温培养可明显减少发生概率。 （2） 使用一些特殊菌株，如 Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如 rec类等，使得质粒复制更加稳定。 （3） 质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液中的 NaOH 浓度过高造成的，请大家注意一下！ 3、未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ （1） 大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。 （2） 质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒 DNA 提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。 （3） 菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例

11、如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。 （4） 碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。 （5） 溶液使用不当：溶液 2 和 3 在温度较低时可能出现浑浊，应置于 37保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。 （6） 吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如 TB 或 2YT ，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的

12、拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少 LB 培养液体积。 （7）质粒未全部溶解 (尤其质粒较大时 ) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。 （8）乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。 （9）洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。 （10）洗脱液不合适： DNA 只在低盐溶液中才能被洗脱， 如洗脱缓冲液 EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA ，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH 值，最大洗脱效率在 pH7.0-8.5 间。当用水洗脱时确保其 pH 值在此范围内，如果 pH 过

13、低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至 60后使用，有利于提高洗脱效率。 （11）洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。 （12）洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置 1min 可达到较好的效果。 4、细菌离心加入溶液 I 蜗旋振荡后，发现菌体呈絮状不均匀或呈细砂状？ （1） 很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间或者试试平板培养，质粒提取前用 PBS 将菌落洗下，相较来说固体培养基上细菌生长的要好一些。 （2） 质粒抽提过程很大程度上是受细菌生长情况决定的，刚活化的菌比

14、负 80保存菌种所培养出来的菌液状态好， 保存久的菌株可能会造成质粒浓度低，质粒丢失等不明原因。 （3）判断生长的菌液是否正常，可以用肉眼观察，在光线明亮处摇荡新鲜培养液， 如果发现菌液呈漂絮状， 情况很好。 如果发现呈泥水状，即看不到 絮状，只是感觉很浑浊，则可能提不出好的质粒，或者没有质粒。（4） 菌液不宜生长太浓，摇床速度不宜过高。达到 OD600 1.5 就可以了，（尤其是对于试剂盒提取要注意）另外如果只是简单的酶切验证根本无需酚氯仿抽提（安全考虑，慎重） ，只要溶液 I/ II /III 比例恰当，转管过程仔细吸取不会有太多杂志。 5、为什么加了溶液后，菌体没有逐渐由混浊变澄清？提出

15、来的条带几乎没有，但是 RNA 很亮（没加 RNA 酶）？ 溶液主要就是 NaOH ，如果菌液没有由混浊变澄清，参考见解： （1）可能是因为溶液储存不当，或屡次操作没有及时盖好溶液瓶盖，导致其吸收空气中的 CO2 失效。 RNA 在菌体中量较多，相对少量的菌体裂解，可有较 DNA 明显的条带。 （2）可能是菌量大，加溶液后，菌体并不能完全裂解，所以没有变清，这也会导致质粒产率低下 （3）可能是质粒的拷贝数不高，质粒产率不高如果是使用自己配的试剂，建议做中提或大提； 或者买试剂盒提 用自己配的试剂， 不加 RNA酶，最后 RNA 是很亮的，要去除干净就要用比较好的酶。 （4）如果不是试剂的原因，

16、 可能是质粒表达的过程中使膜蛋白变化 （数量变多），很难使用碱裂解法， 可以尝试用其他比较剧烈的方法 (比如高温或者低温研磨等 ),然后使用一般的发放。 （5）可能质粒随乙醇一起倒掉了。 6、加入溶液 II 后，菌液仍然呈浑浊状态，或者混浊度没有明显的改变？ （1）问题可能是发生在溶液 II 上。首先看看 10SDS是否是澄清的？NaOH 是否是有效的？如果使用的是试剂盒， 也要首先确认溶液 II 是否澄清没有沉淀？ （2） 可能是细菌浓度很高，适当调整增加溶液 I/II/III 的体积。 （3） 可能是 “杂菌”污染，如果菌液生长异常快，就有可能被杂菌污染。这种情况一般表现为和目的菌有相同的

17、抗性，生长速度异常，能够提出质粒， 跑胶的条带也异常的亮，但产物不是自己想要的质粒，要特别注意一下。7、抽提 DNA 去除蛋白质时，为什么要是酚 /氯仿混合使用？怎样使用酚与氯仿较好？ 酚与氯仿都是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。 经过离心， 变性蛋白质的密度比水的密度大， 因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的 DNA 分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶， 大约 10 15的水溶

18、解在酚相中，因而损失了这部分水相中的 DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好， 但氯仿与水不相混溶， 不会带走 DNA。所以在抽提过程中， 混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（ 1:1）使用。 8、呈粉红色的酚可否使用？如何保存酚不被空气氧化？ 保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解 DNA ，一般不可以使用。 为了防止酚的氧化， 可加入疏基乙醇和 8-羟基喹 琳至终浓度为 0.1。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化， 并在一定

19、程度上能抑制 DNase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用 Tris pH8.0 水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层 Tris 水溶液或 TE 缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气防止与空气接触而被氧化。平时保存在4或 20冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。 9、为什么用酚与氯仿抽提 DNA 时，还要加少量的异戊醇？ 在抽提 DNA 时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张 力，可以降低抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为 24：1

20、之 比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为 25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份 24： 1 的氯仿与异戊醇即成） ，同时异戊醇有助于分相，使 离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。 10、加入酚/氯仿抽提，离心后在水相和有机相间没有出现变性蛋白相层，在随后的乙醇沉淀步骤中却出现大量的半透明沉淀，溶解后发现蛋白浓度很高？ 乙醇沉淀时， 较纯的质粒沉淀是白色的 （PEG 纯化的沉淀是透明的肉眼不易发现），如沉淀是半透明的凝胶状，则应是蛋白含量高。 首先看看平衡酚是否已被氧化？ pH 是否是 8.0？其次检测溶液 III 反应完成后的离心上清 pH 是否在 8.0

21、 左右？有时由于溶液 III 配置的问题，会出现溶液 III 反应后离心的上清 pH 与 8.0 偏差较大的现象， 这会降低平衡酚抽提蛋白抽的有效性， pH 偏差过大也会导致水相和平衡酚互溶。 11、使用酚仿抽提方法，质粒的纯度很好，但酶切不能完全切开 ? （1）确认酶的有效性。 （2）平衡酚是否被氧化（正常是黄色，而氧化后是棕色的） 。 （3）是否不小心吸入了痕量的酚。 （4）乙醇沉淀后， 70%乙醇漂洗的是否充分（残留的盐类会影响酶切）。 （5）乙醇漂洗后是否完全干燥（残留的乙醇会影响酶切） 。 12、碱裂解法提取的质粒 DNA 进行琼脂糖电泳进行鉴定时，看到的三条带分别是什么？ 碱法抽提

22、得到质粒样品中不含线性 DNA ， 得到的三条带是以电泳速度的快慢排序的，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起） 。如果你不小心在溶液 II 加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是 20-100kb的大肠杆菌基因组 DNA 的片断。 13、提取质粒中 RNA 没有去除 ？ 可能是 RNase失效或效率不高。 （1）更换 RNase A，并保证其储存条件是正确的 （2）手工提取质粒的，可单独增加一步去除 RNA 的步骤 ，溶液 III反（需要保30minRNA 10min ，室温下去除RNase 应后，在离心的上清中加证 RNase A 是

23、经过失活 DNase的），同时较高温度（如 50）会更加快速完全的去除 RNA，经验所得经过高温处理的质粒质量不是很高。 14、提取的质粒电泳后，为连续的一片火箭状？ （1）质粒如果盐离子多，会有走胶变形的现象， 如果提到的质粒不够纯，会有电泳条带不平齐的现象。 （2）当电压太大时，容易出现火箭状，而降解应该是弥散状。 （3）可能是宿主菌影响的，质粒抽提好后，用酚 -氯仿处理一下再酶切，若有改善，则为宿主菌影响。转化到其它宿主菌再切 。 （4）NaOH 的浓度过高，会出现火箭状的结果。 15、用碱裂解法提取质粒，裂解 5 分钟，没有用酚 / 氯仿抽提，最后用灭菌水溶解质粒 DNA15min 。

24、双酶切后跑胶一条带都没有，原因是什么？ （1）溶解时间稍微短了点，但是根据各个实验室 RNase 不同，这个 条件是不同的。在溶解的过程要涡旋处理促进溶解。 （2）确认一下酶切过程中是不是有 DNA 酶的污染，比如酶切体系的Buffer 或者是水，特别是水中；其次是酶切体系的问题；建议再把提取的产物用 70%酒精重新洗涤一遍，也可以用酚 / 氯仿重新抽提一下。 （3）也可能在用乙醇洗时把质粒倒掉了。 （4）没有用 RNase消化，不要用放久的 RNase否则会有 DNA 酶的污染； （5）在没有进行酶切时 ,把所提的质粒跑一下核酸电泳看看 ,如果是提核酸的问题那这一步电泳结果应该没有大于三千的

25、条带，这样可以先排除核酸提取的问题 . 若是没有酶切时间过长等其他问题的话可以那可以检查一下所用的溶解 DNA 的溶液是否有 DNAse 污染的问题，建议将超纯水换成 TE。 （1）做一次阴性对照 ,拿空白菌涂布在含 amp 的平板上 ,如生长 ,说明amp 过期,一般这种情况不多见。一般粉末状的 amp 不容易失效 ,如果amp 有效的话 ,可以配制远高于标准的浓度 ,如果细菌耐药的话 ,也能生长良好,如不耐药 ,则放置数天仍不见细菌生长。 （2）拿阴性和阳性的细菌各取数个放于高浓度的 amp 液体培养基中 ,如能生长 ,说明空白菌中带有耐药菌 ,建议换菌 . ）提质粒的菌受污染了，重新划线

26、挑单克隆。3（17、培养基、抗生素、质粒提取都没有问题，而细菌菌液提取不到质粒？ 如果是氨苄抗性的，有可能是质粒丢失造成的。主要是培养时间较长， 导致培养基中的 beta-内酰胺酶过多， 作用时间过长， 同时培养基 pH 值降低，氨苄青霉素失活，从而使无质粒的菌株大量增殖。 解决的办法：可以添加葡萄糖，缩短培养时间，改用羧苄青霉素。 用无水乙醇沉淀 DNA，这是实验中最常用的沉淀 DNA 的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA 很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA 溶液是 DNA 以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA 周围的水分子，使 D

27、NA 失水而易于聚合。一般实验中，是加 2 倍体积的无水乙醇与 DNA 相混合，其乙醇的最终含量占 67左右。因而也可改用 95乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比 95乙醇昂贵）。但是加 95的乙醇使总体积增大， 而 DNA 在溶液中有一定程度的溶解，因而 DNA 损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。 折中的做法是初次沉淀 DNA 时可用 95乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用 0.6 倍体积的异丙醇选择性沉淀 DNA。一般在室温下放置 1530 分钟即可。 19、在用乙醇沉淀 DNA 时，为什么一定要加 NaAc 或 NaCl 至最终浓度达0.1

28、0.25mol/L？ 在 pH 为 8 左右的溶液中， DNA 分子是带负电荷的， 加一定浓度的 NaAc或 NaCl ，使 Na+中和 DNA 分子上的负电荷，减少 DNA 分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成 DNA 钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分 DNA 形成 DNA 钠盐而聚合，这样就造成 DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA 中，由于过多的盐杂质存在，影响 DNA 的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。 20、加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用 SDS 与 KAc 来处理？ ，又必须去除之，DNA 本身是一种蛋白质，为了

29、纯化RNase 加进去的加 SDS 可使它们成为 SDS-蛋白复合物沉淀， 再加 KAc 使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的 SDS-蛋白质复合物， 使沉淀更加完全。 也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除 RNase。在溶液中，有人以 KAc代替 NaAc，也可以收到较好效果。 21、为什么在保存或抽提 DNA 过程中，一般采用 TE 缓冲液？ 在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑 DNA 的稳定性及缓冲 液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（ pKa7.2）和硼酸系统 （pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围 (pH)，可作 DNA的保 2产生Ca(PO)存液，但在

30、转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与 Ca 234沉淀；在 DNA 反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用 Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是 TrisH+/Tris ，不存在金属离子的干扰作用， 故在提取或保 存 DNA 时，大都采用 Tris-HCl 系统，而 TE缓冲液中的 EDTA 更能稳定 DNA 的活性。 采用 PEG（6000）沉淀 DNA ，大小不同的 DNA 分子所用的 PEG 的浓度也不同，PEG 的浓度低，选择性沉淀 DNA 分子量大，大分子所需 PEG的浓度只需 1左右，小分子所需 PEG

31、浓度高达 20。本实验选择性沉淀 4.3kb 的 pBR322 质粒 DNA，每毫升加入 0.4 毫升的 30 PEG，其最终 PEG 浓度为 12。PEG 选择性沉淀 DNA 的分辨率大约 100bp。 三、拓展 (二)细菌的收获和裂解。 细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加 热处理等。选择哪一种方法取决于3个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解 后用于纯化质粒DNA的技术。 尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精 确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。

32、 1、大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细 菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。 2、可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。 3、一些大肠杆菌菌株(如

33、HB101的一些变种衍生株) 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。 故从诸 如HB101和TG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。 4、当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株(endA 株，如HB101) 中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在温育(如用限制酶消化)时，质粒DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤(用酚：氯仿进行抽提)可以避免此问

34、题。 5、目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。 (三)质粒DNA的纯化。 常用的纯化方法都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。如，用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的

35、结合量有所不同。 溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加， 从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到饱和(每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子)。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 的首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DN

36、A和宿主DNA的方法。 (四)质粒DNA的小量制备 1细菌的收获和裂解。 1、收获。 1) 将2ml含相应抗生素的LB加入到容量为15ml 并通气良好(不盖紧)的试管中，然后接入一单菌落，于30剧烈振摇下培养过夜。 2) 将1.5ml培养物倒入离心管中，4、12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4。 3) 吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。 2、碱法裂解。 1) 将细菌沉淀，所得重悬于100l用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。溶液I可成批配制，高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4。须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散。 2) 加200l新配制的溶液。盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保

37、离心管的整个内表面均与溶液接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。 3) 加150l用冰预冷的溶液。盖紧管口，将管倒置后温和地振荡10秒钟溶液在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3-5分钟。 4) 用离心机于4、12000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。 5) 可做可不做：加等量酚：氯念，振荡混匀， 用微量离心机于4 以12000g离心 2分钟，将上清转移到另一良心管中。有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。 6) 用2倍体积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。振荡混合， 于室温放置2分钟。 7) 用微量离心机于4

38、以12 000g离心5分钟。 8) 小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。 9) 用1ml70%乙醇于4洗涤双链DNA沉淀，去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。 i. 此法制备的高拷贝数质粒(如Xf3或pUC)，其产量一般约为：每毫升原细菌培养物3-5g。 ii. 如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1l DNA溶液加到另一含8l水的微量离心管内，加1l 10限制酶缓冲液和1单位所需限制酶， 在适宜温育1-2小时。将剩余的DNA贮存于-20。 iii. 此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物：。 3、煮沸裂解。 1) 将细菌沉

39、淀，所得重悬于350lSTET中。STET：0.1mol/L NaCL，10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)，5% Triton X-100。 2) 加25l新配制的溶菌酶溶液10mg/ml，用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制，振荡3秒钟以混匀之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。 秒。40将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为3) 4) 用微量离心机于室温以12000g离心10分种。 5) 用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。 6) 在上清中加入40l 5mol/L乙酸钠(pH5.2)和420l异丙醇，振荡混

40、匀，于室温放置5分钟。 7) 用微量离心机于4以12 000g离心5分种，回收核酸沉淀。 8) 小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。 9) 加1ml 70%乙醇，于4以12 000g离心2分钟。 10)按步骤8)所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体(2-5)分钟。

41、11)用50l含无DNA酶的胰RNA酶(20g/ml)的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振荡，贮存于-20。 注：当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株(endA 株，如HB101 )中小量制粒尤其DNA时，建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶A，以后在Mg 2 存在下温育(V中用限制酶时)质粒DNA可被降解。 在上述方案的步骤9)之间增加一步，即用酚：氯仿进行抽提，可以避免这一问题。 2质粒DNA小量制备的问题与对策 碱裂解和煮沸都极其可靠，重复性也很好，而且一般没有什么麻烦。多年来，在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中，只碰到过两个问题： 1、有些工作者首次进行小量制备时，有时会

42、发现质粒DNA不能被限制酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在，可用离心柱层析注纯化DNA。 2、在十分偶然的情况下，个别小时制备物会出现无质粒DNA的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。 (五)质粒DNA的大量制备 1.在丰富培养基中扩增质粒 许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效，然而在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中，采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物2-5mg质粒DNA，而且重复性也

43、很好。 。培养0.6)约600(DNA 含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期30ml将1) 基中应含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种。 2) 将含相应抗生素的500ml LB或Terrific肉汤培养基(预加温至37)施放入25ml对数晚期的培养物，于37剧烈振摇培养25小时(摇床转速300转/分)，所得培养物的OD 600值约为0.4。 3) 可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液(34mg/ml溶于乙醇)，使终浓度为170g/ml。像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝娄竿行复的质粒，有必要通过扩增。这些质粒只要从生长达到饷新一代的质粒(如pUC质粒)可复

44、制达到很高的拷贝数，因此无需扩增。这些质粒只要从生长达到饱和的细菌培养物即可大量提纯。但用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点，可减少细菌裂解物的体积和粘稠度，极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来，尽管要在生长中的细菌培养物里加入氯霉素略显不便，但用氯霉素处理还是利大于弊。 4)于37剧烈振摇(300转/分)，继续培养12-16小时。 2.细菌的收获和裂解 1、收获。 1) 4以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。 2) 将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)

45、，1mmol/L EDTA(pH8.0)。 3) 按步骤1)所述方法离心，以收集细菌细胞。 2、碱裂解法。 1) 将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物来自收获细菌的步骤3 重悬于10ml(18ml)溶液I中。 2) 加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液10mg/ml，溶于10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)。当溶液的pH值低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。 3) 加20ml(40ml)新配制的溶液。盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。 4) 加15nl(20ml)用冰预冷的溶液。封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相

46、。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、 高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合物。 5) 用合适转头于4以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟， 然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液与细菌裂解物混合不充分步骤4)。 6) 上清过滤至一250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10分钟。 7) 用合适转头于室温以500转/分离心15分钟，回收核酸。如于4离心，盐也会了生沉淀。 乙醇70%小

47、心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用8) 洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。 9) 用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。 (六)质粒DNA的纯化 1聚乙二醇沉淀法提取质粒DNA 1、将核酸溶液所得转入15mlCorex 管中， 再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，用合适转头于4下以10000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA。 2、将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇， 充分混匀， 用SorvallSS34转头(或与其相当的

48、转尖)于室温以10 000转/分离心10分钏， 回收沉淀的核酸。 3、小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70%乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管侄置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。 4、用500l含无DNA酶的胰RNA酶(20g/ml )的TE(pH8.0)溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置30分钟。 5、加500l含13%(w/v)聚乙二醇(PEG 8000)的1.6mol/L NaCl，充分混合，用微量离心机于4以12000g离心5分钟，以回收质粒DNA。 6、吸出

49、上清，用400l TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽1次。 7、将水相转到另一微量离心管中，加100l 10mol/L乙醇铵，充分混匀，加2倍体积(约1ml)乙醇，于室温放置10分钟，于4以12 000g离心5分钟，以回收沉淀的质粒DNA。 8、吸去上清，加200l处于4以12 000g离心2分钟。 9、吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。 10)用500l TE(pH8.0)溶解沉淀1：100稀释用TE(pH8.0) 后测量OD 260，计算质粒DNA的浓度(1OD260=50g质粒DNA/ml)， 然后将DNA贮于-20。 10、

50、纯化。 2一些试剂的生化作用原理 1、溶液 溶霉菌：水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1,4糖苷键，因而具有溶菌作用。 葡萄糖：增加溶液的粘度，防止DNA受机械剪切力作用而降解。 EDTA：金属离子螯合剂，螯合Mg2+，Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶(DNase)对DNA的降解作用(DNase 作用时需要一定的金属离子强度作辅基)，同时EDTA的存在，有利于溶霉菌的作用。因为溶霉菌的反应要求有较低的离子强度环境。 2、溶液-NaOH-SDS液 NaOH：核酸在pH值为59的溶液中是最稳定的，但pH大于12或小于3时，就会引起双键之间氢键的解离而变性。在溶液中的NaOH浓度为0.2N，加入提取液时，该系统的pH就会高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。 SDS：为阴离子表面活性剂，主要功能有：溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，从而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白SDS蛋白质结合为复合物，使蛋白变性沉淀下来，但SDS能抑制核糖核酸没的作用，所以在以后